楊 針，張文智，盧 鵬

(解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院肝膽外科，海南三亞 572000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一[1-3]，多數(shù)患者在得到確診時已發(fā)展至晚期，失去了手術(shù)或其他根治性治療的機會，而對于晚期肝癌患者的治療效果仍未能令人滿意。小干擾RNA(siRNA)在腫瘤基因靶向治療中已成為研究熱點，成為有希望的治療策略[4-5]。siRNA是指具有特定長度和結(jié)構(gòu)的RNA，由雙鏈RNA被核酸內(nèi)切酶切割而成[5-6]，主要通過互補序列的mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在進(jìn)化中高度保守，具有特異性、簡單性及穩(wěn)定性[7]。然而，siRNA在實際應(yīng)用中存在著“脫靶”效應(yīng)[8]、半衰期短、細(xì)胞攝取率低等問題，從而限制了其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。聚乙烯亞胺(PEI)是一種人工合成的陽離子納米基因載體，廣泛應(yīng)用于質(zhì)粒、核苷酸的傳輸[9]。PEI通過氨基上的正電荷與磁性納米顆粒(SPIO)的羧基、siRNA磷酸基上的負(fù)電荷結(jié)合，再通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”將siRNA釋放進(jìn)而發(fā)揮RNA干擾作用[10]。有研究表明，聚乙烯亞胺修飾的磁性納米顆粒(PEI-SPIO)與siRNA結(jié)合后能有效保護(hù)其不被核酸酶降解[11]，順利穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，從而發(fā)揮RNA干擾作用[12]。如何將醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用在肝臟腫瘤的靶向治療已成為研究的熱點。本研究通過構(gòu)建帶有熒光素酶的C57BL/6小鼠原位肝癌模型，再將PEI-SPIO包裹的siRNA注入小鼠體內(nèi)，進(jìn)一步測試PEI-SPIO包裹的siRNA在C57BL/6小鼠原位肝癌中的攝取及siRNA在小鼠腫瘤滯留時間，從而為進(jìn)一步研究PEI-SPIO包裹的siRNA在抑制小鼠肝癌生長的作用提供基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

20只雌性C57BL/6小鼠，8周齡，體重20 g左右(購于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物中心)，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，所有操作均符合空軍軍醫(yī)大學(xué)科研倫理要求(審批號：XJYYLL-2014051)。小鼠肝癌luc-hepa1-6細(xì)胞系由本院實驗室凍存。PEI-SPIO由空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系實驗室合成，Cy5熒光標(biāo)記的siRNA(Cy5-siRNA)由廣州銳博公司合成。Matrigel基質(zhì)膠購于美國Discovery Labware公司，細(xì)胞計數(shù)儀、小動物活體成像儀購于美國Caliper life science公司，微量進(jìn)樣器、D-Luciferin購于美國Goldbio公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

luc-hepa1-6細(xì)胞完全培養(yǎng)基為15%胎牛血清的DMEM，細(xì)胞置于37 ℃的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2luc-hepa1-6細(xì)胞膠懸液制備

將luc-hepa1-6細(xì)胞用胰酶消化，離心，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，最后用Matrigel基質(zhì)膠稀釋成8×107/mL的膠懸液。用微量進(jìn)樣器吸取膠懸液，放置于冰上防止其凝固。

1.2.3C57BL/6小鼠原位肝癌模型構(gòu)建

用戊巴比妥鈉對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。將小鼠仰臥位固定于鼠板，以75%乙醇常規(guī)消毒，于下腹部正中線切開腹部皮膚，依次剪開皮膚、腹膜，由下向上至劍突下，充分暴露肝臟，將微量進(jìn)樣器刺入肝葉內(nèi)約l cm，緩慢推注25 μL含有2×106個luc-hepa1-6細(xì)胞的Matrigel基質(zhì)膠膠懸液，緩慢拔出微量進(jìn)樣器。逐層縫合關(guān)腹，再次乙醇消毒。

1.2.4活體監(jiān)測小鼠體內(nèi)成瘤情況

在小鼠接種原位肝癌第20天按10 μL/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的30 mg/mL D-Luciferin對小鼠進(jìn)行腹腔注射。注射入體內(nèi)15 min后，通過吸入2%異氟烷實施麻醉且在整個顯像過程中持續(xù)吸入，將小鼠仰臥位擺放于LuminaⅡ活體成像系統(tǒng)的暗箱中，進(jìn)行原位肝癌的活體成像。

1.2.5活體檢測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布

在接種原位瘤后的第21天，通過尾靜脈注射PEI-SPIO包裹的siRNA。先將PEI-SPIO在超聲儀中超聲1 h，然后將PEI-SPIO與Cy5-siRNA(siRNA的量按照與小鼠的體重比為0.5 g/kg)按照一定的比例復(fù)合，使其總體積達(dá)到400 μL，室溫孵育30 min。將C57BL/6荷瘤小鼠固定在小鼠固定器中，尾靜脈注射Cy5-siRNA或孵育好的PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物。分別在注射后2、8、24 h用LuminaⅡ活體成像系統(tǒng)選擇激發(fā)光波長在640 nm檢測Cy5標(biāo)記的siRNA在小鼠體內(nèi)的分布情況。

1.2.6原位肝癌的病理檢測

成像結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥麻醉，待麻醉后固定在小鼠版上，從心尖灌注生理鹽水，灌注后留取肝臟、腎臟、脾臟等組織。經(jīng)10%的甲醛固定液固定24～48 h，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)行常規(guī)染色檢查。同時切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，檢測PEI-SPIO在原位肝癌中的分布。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 C57BL/6小鼠原位肝癌模型

在小鼠肝原左葉接種2×106個luc-hepa1-6細(xì)胞，接種后第21天用小動物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠原位肝癌的成瘤情況，結(jié)果顯示luc-hepa1-6細(xì)胞系可在小鼠肝臟種植成瘤，見圖1。

圖1 小鼠接種后第21天原位肝癌的熒光圖

2.2 活體檢測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布

Cy5-siRNA和PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物主要在肝臟、腎臟聚集。Cy5-siRNA于2 h在肝臟聚集達(dá)到高峰，很快轉(zhuǎn)移至腎臟，8 h后可見熒光值開始降低，24 h肝臟部位熒光強度明顯降低。而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物可在肝癌部位持續(xù)存在，24 h后仍可見到Cy5-siRNA的熒光值處于非常高的水平，見圖2。

A.不同時間點Cy5-siRNA在小鼠肝臟腫瘤的熒光分布圖；B.小鼠肝臟腫瘤Cy5-siRNA熒光值的統(tǒng)計分析圖；a：P<0.05。

2.3 肝癌大體標(biāo)本和病理學(xué)切片

小鼠灌注取材結(jié)果顯示，腫瘤在小鼠肝臟左葉，其形態(tài)不規(guī)則呈結(jié)節(jié)狀浸潤生長，表明凹凸不平，質(zhì)地較硬，見圖3。病理切片HE染色結(jié)果顯示，肝癌組織內(nèi)的細(xì)胞為類圓形或不規(guī)則形細(xì)胞異型性明顯，核質(zhì)比明顯失調(diào)，呈塊狀或團(tuán)塊狀分布，見圖4。

圖3 接種后第21天后小鼠原位肝癌大體標(biāo)本圖

圖4 小鼠原位肝癌病理圖(HE，200×)

2.4 普魯士藍(lán)染色

切片普魯士藍(lán)染色鏡下明顯可見肝癌組織中SPIO的藍(lán)色顆粒，證實PEI-SPIO在肝癌中聚集，并能攜帶siRNA到腫瘤組織中，見圖5。

圖5 小鼠原位肝癌普魯士藍(lán)染色結(jié)果(400×)

3 討 論

近年來，siRNA被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療之中，siRNA選擇性地與mRNA的特異性序列結(jié)合從而持續(xù)抑制致病性蛋白的表達(dá)[13-14]，發(fā)揮其抑制腫瘤生長。醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于肝癌的治療中，已成為研究的熱點，其為肝癌腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向[15-16]。本研究將納米材料PEI-SPIO與siRNA結(jié)合，檢驗PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠原位肝癌的持續(xù)時間，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。hepa1-6細(xì)胞是來源于C57小鼠的BW7756肝癌細(xì)胞系，所以，luc-hepa1-6細(xì)胞構(gòu)建的小鼠原位肝癌模型在組織學(xué)上與人的肝癌高度相似，能夠為本研究肝癌的發(fā)病機制、藥物療效評價及治療方法提供動物模型。DUAN等[12]通過PEI-SPIO包裹的siRNA來治療關(guān)節(jié)炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對照組，PEI-SPIO包裹的siRNA組能明顯延長siRNA在小鼠體內(nèi)的半衰期。因此，本課題組將PEI-SPIO與siRNA結(jié)合來驗證PEI-SPIO在小鼠肝癌組織中保護(hù)siRNA的能力及延長其半衰期，從而為醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于肝癌的治療提供了新的方法。

本研究首先通過luc-hepa1-6細(xì)胞在C57BL/6小鼠肝左葉建立小鼠原位肝癌模型，在建立模型過程中選擇肝左葉是因為小鼠肝左葉體積相對于其他肝葉大，能夠容納25 μL體積的細(xì)胞膠懸液。在小鼠接種原位肝癌后的第21天通過尾靜脈注射Cy5-siRNA或PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物，分別在注射后的2、8、24 h監(jiān)測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cy5-siRNA在小鼠肝癌中2 h到達(dá)高峰，8 h后可見siRNA的熒光值開始降低，24 h后不能見到siRNA的熒光值，而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物可在肝癌中持續(xù)存在，24 h仍可在腫瘤部位見到Cy5-siRNA聚集，說明PEI-SPIO包裹的siRNA能明顯延長siRNA在小鼠肝癌組織中的半衰期。進(jìn)一步灌注取材后可見肝左葉腫瘤組織，腫瘤病理切片證實為腫瘤細(xì)胞，同時可在腫瘤組織的普魯士藍(lán)染色中見到PEI-SPIO，證明SPIO能夠攜帶siRNA進(jìn)入腫瘤組織中，為進(jìn)一步發(fā)揮siRNA干擾抑制的作用提供載體。

綜上所述，通過將小鼠原位肝癌模型與PEI-SPIO包裹的siRNA結(jié)合建立的模型，為研究肝癌的治療提供了新的思路，同時也為醫(yī)用納米材料對腫瘤的治療提供了新的手段。PEI-SPIO包裹的siRNA能夠到達(dá)小鼠原位肝癌部位，并在腫瘤組織中持續(xù)存在一定時間。因此，今后有望通過PEI-SPIO包裹的siRNA實現(xiàn)針對肝癌的基因治療，提高肝癌的總體治療效果。