孫 琦，曲新藝，徐 莉

（威海市疾病預(yù)防控制中心，山東 威海 264200）

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原體。免疫印跡法是HIV抗體檢測(cè)的確認(rèn)方法之一，但HIV早期感染、特殊體質(zhì)、試劑設(shè)計(jì)等影響因素會(huì)導(dǎo)致HIV抗體的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)“不確定”。隨著樣本檢測(cè)量的增多，大量的HIV抗體“不確定”結(jié)果不僅給實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作及AIDS的防治工作帶來諸多問題，同時(shí)也給受檢者造成嚴(yán)重的負(fù)面影響及心理負(fù)擔(dān)[1]。本研究擬通過分析HIV-1抗體不確定者的初篩結(jié)果、免疫印跡法帶形及其轉(zhuǎn)歸情況，為HIV抗體的準(zhǔn)確檢測(cè)和AIDS的早期診斷、有效防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

從2011—2020年威海市各區(qū)縣疾病預(yù)防控制中心、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、采供血機(jī)構(gòu)送檢的“HIV感染待確定”血清或血漿樣本中，由威海市疾病預(yù)防控制中心復(fù)檢出997例陽性樣本，其中有75例HIV-1抗體的免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果為不確定，對(duì)這75例患者進(jìn)行隨訪。

1.2 方法

采用人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒[酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），美國(guó)伯樂公司，不區(qū)分HIV抗原抗體]，人類免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗體檢測(cè)試劑盒（膠體硒法，美國(guó)Alere Medical公司）進(jìn)行初篩。采用人類免疫缺陷病毒（HIV1+2型）抗體檢測(cè)試劑盒（免疫印跡法，新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司）進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。檢測(cè)儀器為Coda全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂公司）和Profiblot 48 全自動(dòng)蛋白印跡儀（瑞士TECAN公司）。HIV-1抗體不確定的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》（2009年修訂版）[2]中的規(guī)定（出現(xiàn)HIV抗體特異條帶，但不足以判定陽性）報(bào)告HIV抗體不確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用Excel 2007軟件、Stata 13.0軟件、RStudio 14軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)。在ELISA結(jié)果分析中，以S/CO值作為統(tǒng)計(jì)變量，以最終診斷結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，設(shè)定預(yù)測(cè)模型，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析ELISA S/CO值判定HIV-1抗體不確定樣本為陽性的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1抗體檢測(cè)結(jié)果為不確定的患者分布及轉(zhuǎn)歸情況

75例HIV抗體檢測(cè)結(jié)果為不確定的患者中，男64例（85.3%）、女11例（14.7%），年齡（36.13±13.77）歲。75例患者中有53例完成隨訪，隨訪時(shí)間為10～721 d；失訪22例。在53例成功隨訪的患者中，男性轉(zhuǎn)陽率為95.4%（42/44），女性轉(zhuǎn)陽率為44.4%（4/9），不同性別轉(zhuǎn)陽率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.802，P＜0.05）。75例患者的轉(zhuǎn)歸情況見表1。

表1 75例HIV抗體檢測(cè)結(jié)果為不確定的患者的轉(zhuǎn)歸情況 例

2.2 HIV-1抗體檢測(cè)結(jié)果為不確定患者初篩檢測(cè)結(jié)果與隨訪后確證結(jié)果的比較

53例隨訪患者中，2種初篩試劑均陽性45例，與隨訪后確證結(jié)果的陽性符合率為100%；2種初篩試劑單陽性8例，而隨訪后確證結(jié)果僅1例陽性，陽性符合率為12.5%（1/8）。見表2。

表2 2種初篩試劑檢測(cè)結(jié)果與確證結(jié)果對(duì)比 例

2.3 ELISA S/CO值判定HIV-1抗體不確定樣本為陽性的效能

以最終診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ELISA S/CO值（0.03～12.58）繪制ROC曲線。ELISA S/CO值判定HIV-1抗體不確定樣本為陽性的曲線下面積（area under curve，AUC）[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.969（0.920～1.000），最佳臨界值為4.995，敏感性為84.8%，特異性為100%，Youden指數(shù)為0.848，陽性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為50%，總體正確率為86.8%。見圖1。

圖1 ELISA S/CO值判定HIV-1抗體不確定樣本為陽性的ROC曲線

2.4 ELISA S/CO值與免疫印跡法帶型及轉(zhuǎn)歸結(jié)果的關(guān)系

隨著ELISA S/CO值的增大，免疫印跡法帶型更復(fù)雜，不確定樣本的轉(zhuǎn)陽率逐漸升高。有1例樣本的ELISA S/CO值為11.57，膠體硒法為陰性，免疫印跡法未出現(xiàn)條帶；15 d后再次檢測(cè)，ELISA、膠體硒法和免疫印跡法均為陽性。免疫印跡法不確定帶型主要有env帶的gp160、gp120和gag帶的p24、p17，pol帶出現(xiàn)較少。見表3。

表3 ELISA S/CO值與免疫印跡法帶型分布的關(guān)系

2.5 HIV-1抗體不確定樣本轉(zhuǎn)歸的隨訪時(shí)間及免疫印跡法條帶的變化

7例隨訪后轉(zhuǎn)為陰性的HIV-1抗體不確定樣本的隨訪時(shí)間為24～115 d，免疫印跡法條帶數(shù)無未增加，有的甚至減少了。46例隨訪后轉(zhuǎn)為陽性的HIV-1不確定樣本的隨訪時(shí)間為10～721 d，免疫印跡法env帶gp41和gag帶p66、p51的出現(xiàn)率均隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，其他條帶變化無規(guī)律。見表4。

表4 46例隨訪后轉(zhuǎn)為陽性的HIV-1不確定樣本的隨訪時(shí)間及免疫印跡法條帶的變化

3 討論

HIV感染后數(shù)周，人體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)抗HIV特異性抗體反應(yīng)，稱為血清轉(zhuǎn)陽。HIV體液免疫應(yīng)答的高峰約出現(xiàn)在感染第12周，包括抗被膜抗體和抗核心蛋白p24抗體[3]。免疫印跡法是目前應(yīng)用最廣泛的HIV確證試驗(yàn)，但常會(huì)出現(xiàn)不確定結(jié)果。我國(guó)近年來的研究結(jié)果顯示，HIV初篩陽性而免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果為不確定的樣本占2%～15%[4-5]。本研究結(jié)果顯示，997例HIV初篩陽性樣本中，免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果為不確定的樣本占7.5%（75/997）。國(guó)內(nèi)外有很多學(xué)者對(duì)導(dǎo)致HIV抗體檢測(cè)出現(xiàn)不確定的影響因素進(jìn)行了研究[6-8]，原因主要有以下幾個(gè)方面：（1）由于懷孕、過敏體質(zhì)、自身免疫性疾病、腫瘤等特殊生理或病理狀況的存在，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)非病毒蛋白抗體的交叉反應(yīng)；（2）由于試劑盒設(shè)計(jì)過程中宿主細(xì)胞蛋白純化、檢測(cè)過程中的樣本處理等原因?qū)е碌姆翘禺愋苑磻?yīng)；（3）處于HIV感染的早期，抗體滴度低，易出現(xiàn)不確定結(jié)果，但隨著病程的進(jìn)展，最終會(huì)轉(zhuǎn)為 HIV 抗體陽性；（4）處于AIDS的終末期，機(jī)體免疫力降低，抗體水平下降，導(dǎo)致不確定條帶反復(fù)出現(xiàn)。《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》（2020年修訂版）[9]優(yōu)化了抗原抗體、核酸檢測(cè)的流程及不確定結(jié)果的隨訪要求，為不確定結(jié)果提供了快速有效的試驗(yàn)方案和隨訪策略。

本研究結(jié)果顯示，ELISA的敏感性和特異性均高于膠體硒法，2種初篩試劑的檢測(cè)結(jié)果與確證結(jié)果的陽性符合率為100%；ROC曲線分析結(jié)果顯示，ELISA S/CO值判定HIV-1抗體不確定樣本為陽性的AUC為0.969，最佳臨界值為4.995，敏感性為84.8%，特異性為100%。當(dāng) ELISA S/CO值＞4.995時(shí)，ELISA與確證結(jié)果的陽性符合率為100%，提示利用S/CO值的最佳臨界值判斷HIV-1抗體不確定樣本有較高的臨床價(jià)值[10]。本研究中有1例樣本的ELISA S/CO值為11.57，膠體硒法為陰性，免疫印跡法未出現(xiàn)條帶，15 d后再次檢測(cè)，ELISA、膠體硒法和免疫印跡法均為陽性。該例患者可能處于HIV感染的極早期，雖然ELISA陽性，但免疫印跡法未檢測(cè)到相應(yīng)的特異性抗體。由此可見，對(duì)于疑似窗口期感染的患者，除了要及時(shí)溝通，做好隨訪和復(fù)檢工作外，有條件的地區(qū)建議加做HIV RNA檢測(cè)，以輔助診斷HIV感染。由于威海市疾病預(yù)防控制中心尚未配備HIV核酸檢測(cè)系統(tǒng)，因此本研究只針對(duì)HIV-1抗體不確定樣本的篩查結(jié)果和免疫印跡法結(jié)果進(jìn)行分析。另外，本研究還總結(jié)了HIV-1抗體不確定樣本轉(zhuǎn)歸的隨訪時(shí)間和免疫印跡法條帶的變化情況，為判斷HIV感染者的感染時(shí)間及狀態(tài)提供參考。

綜上所述，HIV-1抗體檢測(cè)的不確定結(jié)果可通過膠體硒法、ELISA S/CO值和免疫印跡法條帶的分析來協(xié)助判斷。如能結(jié)合HIV核酸檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀等進(jìn)行綜合分析，將進(jìn)一步提高HIV感染診斷的準(zhǔn)確率。