柳行強(qiáng)，寧立芬，李 琳，陳忠成

（武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430050）

目前，肺癌已成為發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)肺癌220.7萬(wàn)例，死亡179.6萬(wàn)例[1]。肺癌患者的5年生存率低于15%，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期[2]。雖然肺癌的治療方法已取得到了較大的進(jìn)展，但仍缺乏有效的預(yù)后判斷指標(biāo)，導(dǎo)致預(yù)后較差[3]。因此，尋找肺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的判斷指標(biāo)，對(duì)改善患者預(yù)后、提高治愈率具有重要意義。葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）是一種糖基磷脂?；寂悸?lián)蛋白，正常人血液中無(wú)表達(dá)，是理想的肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的檢測(cè)靶點(diǎn)[4]。膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2，ANXA2）是膜聯(lián)蛋白家族重要成員之一，其異常表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。胃泌素釋放肽前體（gastrin-releasing peptide precursor，ProGRP）能夠通過(guò)細(xì)胞間相互作用或自身分泌導(dǎo)致更具侵略性的腫瘤行為和患者更短的生存期[6]。本研究擬探討葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞（folate receptor positive circulating tumor cell，F(xiàn)R+-CTC）、ANXA2、ProGRP在肺癌中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月—2019年12月武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院肺癌患者116例，其中男76例、女40例，年齡（58.8±8.7）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)肺癌篩查與早診早治指南（2021，北京）》[7]中關(guān)于原發(fā)性肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)確診；（3）卡氏功能量表（Karnofsky performance status，KPS）評(píng)分＞60分，且預(yù)計(jì)生存期＞6個(gè)月；（4）未進(jìn)行放化療治療、靶向治療等；（5）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重肝、腎功能不全；（2）合并免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾??；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）妊娠和哺乳期婦女；（5）合并精神疾病。根據(jù)肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]分為Ⅰ期40例、Ⅱ期38例、Ⅲ期30例、Ⅳ期8例。另選取同期武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院肺部良性疾病患者100例作為對(duì)照組，其中男65例、女35例，年齡（59.2±8.6）歲。肺部良性疾病患者均經(jīng)組織病理學(xué)及影像學(xué)確診，既往無(wú)惡性腫瘤史。2個(gè)組之間性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

收集所有患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、影像學(xué)報(bào)告、血液學(xué)檢查報(bào)告等。采集所有患者入院第2天清晨空腹靜脈血6 mL，其中3 mL采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，用于檢測(cè)FR+-CTC；另3 mL置于無(wú)添加劑的干燥真空管中，1 006×g離心10 min后分離血清，用于檢測(cè)ANXA2、ProGRP水平。（1）FR+-CTC檢測(cè)。采用免疫磁珠負(fù)向富集法捕獲EDTA抗凝血樣本中的CTC，采用配體靶向聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)FR+-CTC水平。3 mL血液中檢測(cè)到1個(gè)FR+-CTC即判定為1 FU，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為≥8.7 FU/3 mL。試劑盒購(gòu)自格諾思博生物科技（上海）有限公司，檢測(cè)儀器為ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。（2）ANXA2檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清ANXA2水平，試劑盒購(gòu)自上海希美化學(xué)有限公司，檢測(cè)儀器為Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。以ANXA2＞26 ng/mL為陽(yáng)性。（3）其他指標(biāo)檢測(cè)。采用ARCHITECT i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)雅培公司）及配套試劑檢測(cè)ProGRP、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）。以ProGRP＞69.2 pg/mL為陽(yáng)性。所有項(xiàng)目均嚴(yán)格按儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)診斷肺癌的效能。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估各指標(biāo)間的相關(guān)性。采用多因素Logistic回歸分析評(píng)估肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與對(duì)照組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

肺癌組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 肺癌組與對(duì)照組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

2.2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷肺癌的效能

采用Logistic回歸分析建立FR+-CTC、ANXA2、ProGRP聯(lián)合檢測(cè)的方程：Logist（P）=4.26×ProGRP+1.34×ANXA2+1.09×FR+-CTC-5。ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷肺癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.885、0.810、0.696、0.935。見(jiàn)表2、圖1。

表2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷肺癌的效能

圖1 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP診斷肺癌的ROC曲線

2.3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCCAg均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相關(guān)性分析

2.4 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP在肺癌患者不同臨床病理特征中的表達(dá)

根據(jù)不同臨床病理特征對(duì)肺癌患者進(jìn)行分組。結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP在有吸煙史、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的患者中明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病理特征肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

2.5 影響肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

以是否發(fā)生肺癌為因變量（否=0，是=1），以FR+-CTC、ANXA2、ProGRP陽(yáng)性表達(dá)為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2和ProGRP陽(yáng)性均是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.385、1.774、1.823，95%CI分別為1.187～4.974、1.601～5.075、1.677～6.005]。見(jiàn)表5。

表5 肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

肺癌是起源于支氣管黏膜或支氣管腺體的一種惡性腫瘤，是多種因素共同作用的結(jié)果，常見(jiàn)病因有吸煙、職業(yè)暴露、慢性肺炎等[9]。肺癌的發(fā)病率位居我國(guó)惡性腫瘤的首位，而且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[10]。肺癌患者發(fā)病初期多出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、胸痛、氣短、咯血等癥狀，容易與其他肺部疾病混淆，造成漏診、誤診，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期。肺癌晚期患者的5年生存率僅為5%，而早期肺癌患者的5年生存率可達(dá)57%[11]。雖然病理組織活檢是診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但部分患者存在依從性差或不宜手術(shù)的情況，取樣比較困難。因此，尋求靈敏度高、無(wú)需手術(shù)的診斷指標(biāo)，對(duì)肺癌患者的早期診療尤為重要。

CTC是從實(shí)體腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)入人體外周血液的腫瘤細(xì)胞。CTC檢測(cè)是目前最新的液體活檢技術(shù)，具有方便、快捷、重復(fù)性好的特點(diǎn)，適用于腫瘤的早期診斷。隨著腫瘤細(xì)胞的不斷浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)結(jié)締組織間隙或破裂的毛細(xì)血管進(jìn)入血液循環(huán)，形成CTC[12]。葉酸是一種水溶性的B族維生素，人體自身不能合成，必須從外界攝取，通過(guò)與細(xì)胞表面葉酸受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。葉酸受體在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，尤其是肺癌和卵巢癌等多種上皮性腫瘤細(xì)胞，而正常組織幾乎不表達(dá)或低表達(dá)。目前，葉酸受體已成為檢測(cè)人體內(nèi)CTC的理想靶點(diǎn)[13]。唐興等[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)R+-CTC可作為肺癌篩查的指標(biāo)。ZHOU等[15]認(rèn)為，F(xiàn)R+-CTC檢測(cè)是鑒別不明原因肺部孤立結(jié)節(jié)惡性程度的可靠方法，F(xiàn)R+-CTC計(jì)數(shù)和熱成像診斷技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)增強(qiáng)術(shù)前對(duì)肺結(jié)節(jié)侵襲性的判斷，避免非侵襲性病變患者的過(guò)度治療。CHEN等[16]報(bào)道，F(xiàn)R+-CTC還可作為預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者化療效果的潛在的生物標(biāo)志物。ANXA2是來(lái)源于與鈣離子相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，參與維持肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞骨架，而細(xì)胞骨架的改變與腫瘤的增殖、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)[17]。ProGRP是一種胃腸激素，廣泛存在于肺組織神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，主要作用是刺激G細(xì)胞產(chǎn)生胃泌素、收縮平滑肌、促進(jìn)細(xì)胞間相互作用、調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。ProGRP在小細(xì)胞肺癌中顯著升高，可用于鑒別肺癌的病理類(lèi)型[18]。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平顯著升高，提示這些指標(biāo)可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展；ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP聯(lián)合檢測(cè)可以提高肺癌的診斷效能。

本研究結(jié)果還顯示，F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP水平與吸煙史、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)R+-CTC、ANXA2、ProGRP陽(yáng)性表達(dá)是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。因此，通過(guò)檢測(cè)FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平有助于了解肺癌患者的臨床病理特征和轉(zhuǎn)移情況，評(píng)估患者的病情進(jìn)展和治療效果。

綜上所述，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平明顯升高，且與臨床病理特征及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是肺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，聯(lián)合檢測(cè)有利于患者的早期診斷、病情評(píng)估及預(yù)后判斷。但本研究屬于回顧性研究，標(biāo)本量較小，且來(lái)自同一個(gè)地區(qū)，可能存在一定地域偏差，有待日后進(jìn)行大樣本量、多中心研究，以期為肺癌的診斷及預(yù)后提供全新思路。