高 盼， 李恒彬， 陳 哲， 楊歆萌， 胡傳榮， 何東平,3， 張 暉， 張躍進(jìn)， 王興國(guó),

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023； 3.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食用油質(zhì)量與安全)，武漢 430012； 4.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢 430012； 5.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 6.云南摩爾農(nóng)莊生物科技開發(fā)有限公司，云南 楚雄 675000)

我國(guó)是全球最大的核桃生產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是全球最大的核桃消費(fèi)國(guó)，核桃主要的消費(fèi)方式是作為堅(jiān)果食用和提取核桃油，對(duì)于核桃提油后產(chǎn)生的核桃粕的利用卻很少(核桃粕中含有大量蛋白質(zhì)[1])，造成了極大的資源浪費(fèi)。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，含有豐富的人體必需氨基酸，同時(shí)也滿足FAO/WHO對(duì)氨基酸攝入量的建議[2-5]。目前核桃蛋白多數(shù)僅為初加工產(chǎn)品，缺少高純度的產(chǎn)品，無法占領(lǐng)食品原料和功能性食品添加劑市場(chǎng)，制約了核桃蛋白產(chǎn)品的發(fā)展。雖然已有研究者[6]優(yōu)化了工藝，提高了核桃粕中蛋白質(zhì)的提取率，但得到的蛋白純度仍較低，不適合直接利用。高品質(zhì)的核桃蛋白主要來源于蛋白質(zhì)含量高于90%的核桃分離蛋白，而為了提高核桃蛋白的市場(chǎng)占有率，有必要對(duì)其進(jìn)行純化處理[7]。

蛋白純化是利用蛋白質(zhì)物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，使其達(dá)到純化的目的[7]。蛋白純化的傳統(tǒng)方法是沉淀法，該方法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、回收率高、設(shè)備要求低的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)蛋白的選擇性不高，適用于蛋白的初步純化和濃縮[8]。酶法是現(xiàn)今蛋白提取純化的常用方法[8]，其中糖化酶純化是較為普遍的提純方法，可將可溶性糖等非蛋白質(zhì)組分溶出[9]，在蛋白提取純化方面有著廣泛的應(yīng)用[10]，已在棉籽蛋白[9]和米糠蛋白[11]中被證明具有很好的純化效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇糖化酶作為純化用酶，純化核桃蛋白制備核桃分離蛋白，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)糖化酶純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過與低變性核桃蛋白粉比較考察核桃分離蛋白的氨基酸組成及功能特性，為高品質(zhì)的核桃分離蛋白開發(fā)利用提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

核桃蛋白，由實(shí)驗(yàn)室制備(核桃仁經(jīng)脫脂、粉碎后經(jīng)酶法輔助堿溶酸沉制備)，其蛋白質(zhì)含量約為70%，水解度為4.50%。

糖化酶(1.5×105U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、硫酸、硼酸溶液、硫酸銅、鹽酸、硫酸鉀、乙醚、95%乙醇溶液、溴甲酚綠指示劑、甲基紅指示劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；FD-8型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；TDSZ臺(tái)式離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；通用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；pH-Stat裝置，上海亞榮生化儀器廠；101-1-S數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；L8800型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃分離蛋白的純化工藝

核桃蛋白→加水溶解→調(diào)節(jié) pH →調(diào)節(jié)溫度→加入糖化酶→酶解→高溫滅酶(85℃，15 min)→調(diào)節(jié)pH至7.0→5 000 r/min離心10 min→加水洗滌(45℃，10 min)→調(diào)節(jié)pH至7.0→真空冷凍干燥→核桃分離蛋白。

1.2.2 基本指標(biāo)的計(jì)算

蛋白提取率=提取液中蛋白質(zhì)總量/原料中蛋白質(zhì)總量×100%；蛋白純度=干物質(zhì)的蛋白質(zhì)質(zhì)量/干物質(zhì)的質(zhì)量×100%。

1.2.3 核桃蛋白的氨基酸組成及功能特性分析

1.2.3.1 氨基酸組成

在核桃蛋白中加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空充氮后封口。在110℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，取出過濾定容至50 mL。取1 mL濾液真空干燥，用蒸餾水溶解，過膜備用。

氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定條件：陽(yáng)離子交換樹脂色譜柱(4.6 mm×60 mm，3 μm)，進(jìn)樣量20 μL，檸檬酸鈉緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮流速0.4 mL/min，衍生溫度135℃，測(cè)定波長(zhǎng)570、440 nm。

1.2.3.2 功能特性

參考Ajibola等[12]的方法并略作修改對(duì)持水性和吸油性進(jìn)行測(cè)定；參考李超等[13]的方法并略作修改對(duì)乳化性進(jìn)行測(cè)定。

(1)持水性的測(cè)定

稱取1.0 g待測(cè)樣品，加入10 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置不同溫度保溫30 min。將混合溶液倒入離心管中，4 500 r/min離心20 min，去除上層溶液后，稱離心管質(zhì)量。按下式計(jì)算持水性(Y1)。

Y1=(m2-m1)/m

(1)

式中：m為樣品質(zhì)量，g；m2為離心管和沉淀物的總質(zhì)量，g；m1為離心管和樣品的總質(zhì)量，g。

(2)吸油性的測(cè)定

稱取1.0 g待測(cè)樣品，加入10 mL一級(jí)大豆油，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置不同溫度保溫30 min。將混合溶液倒入離心管中，4 500 r/min離心20 min，去除上層溶液后，稱離心管質(zhì)量。吸油性(Y2)計(jì)算按式(1)。

(3)乳化性的測(cè)定

稱取2.0 g樣品，加入40 mL 蒸餾水溶解，將溶液調(diào)節(jié)為不同pH，再加入40 mL一級(jí)大豆油，10 000 r/min均質(zhì)2 min，1 500 r/min離心10 min，測(cè)定離心管中乳化層高度(H1)和液體總高度(H)。按下式計(jì)算乳化性(Y3)。

Y3=H1/H×100%

(2)

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析、作圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示。用SPSS 23.0的Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白純化的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 加酶量對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解時(shí)間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調(diào)節(jié)加入糖化酶的量分別為20、40、60、80、100、120、140、160 U/g，探究加酶量對(duì)核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 加酶量對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖1可見，隨著加酶量的增加，蛋白提取率先增加后減少，當(dāng)加酶量為80 U/g時(shí)，蛋白提取率最高，為82.04%，其后蛋白提取率逐漸下降。而蛋白純度的變化相對(duì)較小，在加酶量為80 U/g時(shí)，蛋白純度也達(dá)到了最高，為81.90%。因此，確定最佳的加酶量為80 U/g。

2.1.2 料液比對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、酶解溫度60℃、酶解時(shí)間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12，探究料液比對(duì)核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖2可見，隨著料液比的增加，蛋白提取率逐漸增加，當(dāng)料液比超過1∶10時(shí)，再增加料液比，蛋白提取率增速明顯減緩。而蛋白純度隨著料液比的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，在料液比為1∶10時(shí)，蛋白純度最高，為83.84%。因此，選擇最佳料液比為1∶10。

2.1.3 酶解溫度對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解時(shí)間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調(diào)節(jié)酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃，探究酶解溫度對(duì)核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖3可見，隨著酶解溫度的升高，蛋白提取率變化很小，其提取率范圍為82.77%～84.16%，提取率在55℃時(shí)達(dá)到最高。蛋白純度隨著酶解溫度的上升呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，蛋白純度達(dá)到最高，為84.82%。而繼續(xù)升高溫度，蛋白純度顯著下降，這可能是由于溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的熱變性，導(dǎo)致其溶解度下降，從而造成蛋白純度下降。綜合考慮提取率和純度結(jié)果，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，蛋白提取率為83.96%，僅次于峰值，因此選擇60℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解pH 4.0的條件下，調(diào)節(jié)酶解時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，探究酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖4可見，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率逐漸降低，從83.72%下降到73.08%，下降了10.64百分點(diǎn)，而核桃蛋白純度呈先顯著增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，特別是在酶解時(shí)間30 min之后，蛋白純度不再增加。這可能是由于初始酶解時(shí)，核桃蛋白的溶出速率較大，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，整個(gè)體系黏度增大，未溶出的核桃蛋白在傳質(zhì)過程中受到黏度的牽制，其溶出速率減慢，糖化酶酶解達(dá)到飽和后蛋白純度不再提高。酶解30 min時(shí)，蛋白純度為83.64%，而提取率為79.48%，也相對(duì)較高。因此，綜合考慮選擇最佳酶解時(shí)間為30 min。

2.1.5 酶解pH對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解時(shí)間30 min的條件下，調(diào)節(jié)酶解pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，探究酶解pH對(duì)核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解pH對(duì)蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖5可見，隨著酶解pH的增大，核桃蛋白提取率和蛋白純度都呈先上升后下降的趨勢(shì)，兩者都在pH為4.0時(shí)達(dá)到最大，分別為83.72%和82.64%。這可能是由于糖化酶的最適pH在4.0左右，pH過高或過低都會(huì)降低糖化酶的活性，導(dǎo)致蛋白提取率和純度下降。因此，選擇pH 4.0為最佳酶解pH。

2.2 核桃蛋白純化的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度(A)、酶解pH(B)、酶解時(shí)間(C)、加酶量(D)和料液比(E)5個(gè)因素為考察對(duì)象，蛋白純度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知，5個(gè)因素對(duì)蛋白純度影響大小順序?yàn)锳>C>B>D>E，即酶解溫度>酶解時(shí)間>酶解pH>加酶量>料液比。

蛋白純度直觀圖如圖6所示。由圖6可知：酶解溫度以55℃最佳；酶解pH以4.0最佳；酶解時(shí)間以40 min最佳；雖然圖中加酶量100 U/g最佳，但與80 U/g的結(jié)果相差不大，且通過極差分析發(fā)現(xiàn)，加酶量對(duì)蛋白純度的影響不大，從節(jié)約資源的角度出發(fā)，加酶量以80 U/g最佳；料液比以1∶8最佳。因此，理論最優(yōu)方案為A2B2C3D2E1。通過3次平行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，理論最優(yōu)方案的蛋白純度為93.86%，蛋白提取率為91.06%，略差于實(shí)驗(yàn)組的最優(yōu)方案A2B4C3D2E1下的結(jié)果(蛋白純度為94.37%，蛋白提取率為91.77%)。因此，以實(shí)驗(yàn)組的條件為最優(yōu)方案，即酶解溫度55℃、酶解pH 5.0、酶解時(shí)間40 min、加酶量80 U/g、料液比1∶8，在此條件下蛋白純度可達(dá)到核桃分離蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 蛋白純度直觀分析趨勢(shì)圖

2.3 核桃分離蛋白與低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成與功能特性比較

2.3.1 氨基酸組成比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證制備的核桃分離蛋白品質(zhì)，將最優(yōu)條件下制備的核桃分離蛋白與僅由核桃仁脫脂制備的低變性核桃蛋白粉進(jìn)行比較。核桃分離蛋白與低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成比較結(jié)果見表2。

表2 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成及含量 g/100 g

由表2可知，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成都較為全面，均含有7種人體必需氨基酸(色氨酸未測(cè))，證明了核桃是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。其中，核桃分離蛋白的氨基酸總量高達(dá)94.93 g/100 g，必需氨基酸含量為22.29 g/100 g，均高于低變性核桃蛋白粉(氨基酸總量52.33 g/100 g，必需氨基酸含量16.49 g/100 g)。此外，對(duì)人體有著重要生理功能的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均高于低變性核桃蛋白粉。

2.3.2 持水性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著溫度變化的持水性比較如圖7所示。由圖7可知，隨著溫度的升高，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的持水性都先上升后下降，在溫度為50℃時(shí)，持水性都達(dá)到最大值，分別為3.72 g/g和1.83 g/g。對(duì)于核桃蛋白樣品而言，溫度升高會(huì)增加蛋白質(zhì)分子的延展性，利于水分的吸收；但當(dāng)溫度持續(xù)升高后，蛋白質(zhì)的熱變性程度增加，蛋白質(zhì)分子的氫鍵和離子基團(tuán)水合作用減弱，使其吸水性降低。而在相同溫度條件下，核桃分離蛋白的持水性始終優(yōu)于低變性核桃蛋白粉。說明經(jīng)過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的持水性得到了提升。

注：圖中同一曲線不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同圖7 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的持水性比較

2.3.3 吸油性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著溫度變化的吸油性比較如圖8所示。由圖8可知，隨著溫度的升高，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉吸油性都先上升后下降。而核桃分離蛋白的變化程度明顯大于低變性核桃蛋白粉，在溫度為50℃時(shí)，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的吸油性都達(dá)到最大值，分別為1.57 g/g和0.62 g/g。對(duì)于核桃蛋白樣品而言，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，油脂黏度下降，流動(dòng)性增大，蛋白質(zhì)分子間的吸附作用減弱，吸油性變差。而在相同溫度條件下，核桃分離蛋白的吸油性始終優(yōu)于低變性核桃蛋白粉。說明經(jīng)過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的吸油性得到了提升。

圖8 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的吸油性比較

2.3.4 乳化性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著pH變化的乳化性比較如圖9所示。由圖9可知，隨著pH的增加，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性都呈先略微下降后顯著上升的趨勢(shì)。而核桃分離蛋白的上升程度明顯大于低變性核桃蛋白粉，在pH為9.0時(shí)，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性都達(dá)到最大值，分別為57.60%和21.22%。蛋白質(zhì)分子中存在大量親水或親油的基團(tuán)，這些基團(tuán)在乳化體系形成過程中起到了乳化作用，核桃蛋白的等電點(diǎn)在5.0左右，當(dāng)溶液體系接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶電荷為零，蛋白質(zhì)表面無法形成水化層，使得乳化粒子發(fā)生絮凝和聚集作用，乳化性能降低；當(dāng)溶液體系在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解性增加，乳化程度升高。而在相同pH條件下，核桃分離蛋白的乳化性始終優(yōu)于低變性核桃蛋白粉。說明經(jīng)過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的乳化性得到了提升。

圖9 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性比較

3 結(jié) 論

本研究采用糖化酶酶解純化核桃蛋白制備核桃分離蛋白。通過單因素實(shí)驗(yàn)，分析加酶量、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH 5個(gè)因素對(duì)核桃蛋白提取率和純度的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工藝條件，最終得到了最佳工藝條件為加酶量80 U/g、料液比1∶8、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間40 min、酶解pH 5.0，在此條件下蛋白純度為94.37%，符合核桃分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)。通過比較核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成及功能特性發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白的氨基酸組成全面，含有7種人體必需氨基酸，且核桃分離蛋白的氨基酸總量和必需氨基酸含量均高于低變性核桃蛋白粉，且核桃分離蛋白產(chǎn)品持水性(3.72 g/g)、吸油性(1.57 g/g)和乳化性(57.60%)皆優(yōu)于低變性核桃蛋白粉，說明制備的核桃分離蛋白具有良好的品質(zhì)及功能特性。