普琳梅, 張紅燕, 陳興瓊, 陳石芬, 倪媛媛, 宋 賢

(云南省傳染病醫(yī)院 藥劑科, 云南 昆明, 650103)

兩性霉素B是一種多烯類抗真菌藥物，具有抗菌作用較強(qiáng)、抗菌譜較廣及藥物相互作用較少的優(yōu)勢(shì)，是艾滋病合并真菌感染的一線用藥，也是危及生命的侵襲性真菌感染和出現(xiàn)三唑類、棘白菌素類藥物耐藥的重癥復(fù)雜基礎(chǔ)疾病患者的重要選擇[1-3]。然而，兩性霉素B具有腎毒性、肝毒性和血液系統(tǒng)毒性等[4], 使得其臨床應(yīng)用受到限制。治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)可為臨床抗真菌治療方案的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)，從而改善藥物治療效果，預(yù)防與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)，并減少抗真菌藥物耐藥情況的發(fā)生[5]。因此，應(yīng)用兩性霉素B治療真菌感染患者時(shí)，開(kāi)展TDM是非常必要的。目前，兩性霉素B的血藥濃度監(jiān)測(cè)方法主要為高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7], 其中質(zhì)譜法具有較高的靈敏度，但成本高，推廣難度大，而傳統(tǒng)HPLC樣品前處理操作復(fù)雜，色譜柱容易被血漿內(nèi)源性物質(zhì)堵塞，內(nèi)標(biāo)物不易購(gòu)買，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且易出現(xiàn)干擾峰和保留時(shí)間漂移情況，不利于臨床常規(guī)開(kāi)展兩性霉素B的TDM[8-9]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，二維高效液相色譜法(2D-HPLC)已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣本的分離，并被逐漸應(yīng)用于血藥濃度的監(jiān)測(cè)中[10]。本研究基于2D-HPLC建立兩性霉素B的血藥濃度測(cè)定方法，以期為臨床常規(guī)開(kāi)展兩性霉素B血藥濃度監(jiān)測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

2D-HPLC系統(tǒng)由FLC2801全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀(湖南德米特儀器有限公司)和島津LC-30A液相色譜部件構(gòu)成。FLC2801全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀通過(guò)微流控系統(tǒng)將色譜泵、檢測(cè)器、進(jìn)樣器等色譜部件耦合在一起，構(gòu)成第一維液相色譜系統(tǒng)(LC1)與第二維液相色譜系統(tǒng)(LC2), 被分析物質(zhì)通過(guò)FLC2801微流控系統(tǒng)從LC1轉(zhuǎn)移至LC2, 完成待測(cè)樣本的分析，工作站為L(zhǎng)C Solution工作站，具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1; HR-200電子分析天平(AND, 日本); MINI-15K高速離心機(jī)(奧盛，中國(guó)); XW-80A漩渦混合器(琪特，中國(guó))。

LC1: 第一維液相色譜系統(tǒng)(1: 第一維色譜泵; 2: 進(jìn)樣器; 3: 第一維色譜柱; 4: 廢液收集器); LC2: 第二維液相色譜系統(tǒng)(5: 第二維色譜泵; 6: 第二維色譜柱; 7: 二級(jí)管陣列檢測(cè)器); TRS: 捕獲柱轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(8: 捕獲柱)。圖1 FLC2801全自動(dòng)二維高效液相色譜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

1.2 藥品與試劑

兩性霉素B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)130628-201501); 甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純)，磷酸、磷酸氫二銨、氨水、高氯酸、乙二醇(分析純)，水為雙重蒸餾去離子水(純水儀所制，不低于GB17323執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn))?？瞻籽獫{和患者血漿均由云南省傳染病醫(yī)院臨床科室提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件: 第一維色譜柱為 Aston SX1色譜柱(3.5 mm×25.0 mm, 5.0 μm), 流動(dòng)相V甲醇∶V乙腈∶V水(25 mmoL/L磷酸銨鹽水溶液)=1∶3∶3, 流速0.7 mL/min; 第二維色譜柱為Aston SCB色譜柱(4.6 mm×125.0 mm, 5.0 μm), 流動(dòng)相V水(25 mmol/L磷酸銨鹽水溶液)∶V水(1.0 mmol/L磷酸氫二銨溶液)∶V甲醇∶V乙腈=10∶35∶10∶45, 流速1.0 mL/min; 中間柱為Aston SCB色譜柱(4.6 mm×10.0 mm, 3.5 μm), 輔助流動(dòng)相為純水。樣本檢測(cè)波長(zhǎng)380 nm, 柱溫40 ℃, 進(jìn)樣體積300 μL, 檢測(cè)流程見(jiàn)表1。

表1 系統(tǒng)各工序的工作時(shí)間段與工作流程

1.3.2 對(duì)照品溶液配制: 精密稱取兩性霉素B對(duì)照品3.48 mg, 用水溶解并定容至25 mL, 配制成濃度為123.2 μg/mL的兩性霉素B對(duì)照品溶液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血漿樣品處理: 將血漿樣品以3 000轉(zhuǎn)/min低速離心5 min, 精密吸取血漿樣品400 μL至2 mL EP管中，加入乙腈去蛋白劑1 000 μL, 渦旋振蕩1 min, 再以14 500轉(zhuǎn)/min高速離心8 min, 然后取上層清液1 000 μL至進(jìn)樣瓶中待測(cè)，進(jìn)樣量為300 μL, 采用外標(biāo)工作曲線法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性考察

取人空白血漿、兩性霉素B對(duì)照品加人空白血漿、患者血漿、兩性霉素B對(duì)照品按“1.3.3”方法進(jìn)行前處理后，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行分析。色譜圖結(jié)果顯示，兩性霉素B保留時(shí)間約為6.39 min, 人空白血漿色譜圖在目標(biāo)峰處未發(fā)現(xiàn)干擾，血漿內(nèi)源性物質(zhì)和及其他雜質(zhì)已完全分離，不影響樣本的含量測(cè)定，見(jiàn)圖2。

2.2 線性范圍和定量限

取質(zhì)量濃度為123.2 μg/mL的兩性霉素B對(duì)照品溶液，分別用人空白血漿稀釋成系列濃度(0.06、0.32、0.79、2.14、4.92、12.31 μg/mL), 按照“1.3.3”方法處理，并按照“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以兩性霉素B的峰面積(Y)對(duì)兩性霉素B濃度(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，兩性霉素B濃度為0.059～12.31 μg/mL時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=683 050X+0(r=0.999 9)。兩性霉素B的最低定量限為0.04 μg/mL[信噪比(S/N)>10, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<5.00%], 檢測(cè)限為0.01 μg/mL(S/N=3,RSD<10.00%), 完全滿足兩性霉素B血藥濃度臨床檢測(cè)要求，見(jiàn)表2。

A: 人空白血漿; B: 人空白血漿+兩性霉素B對(duì)照品; C: 患者血漿; D: 兩性霉素B對(duì)照品。圖2 兩性霉素B的二維高效液相色譜圖

表2 兩性霉素B的最低定量限和檢測(cè)限

2.3 回收率和精密度

取兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液，用人空白血漿將其稀釋成高、中、低濃度(0.40、2.00、8.00 μg/mL)的質(zhì)控樣品，進(jìn)行方法學(xué)準(zhǔn)確度和精密度檢測(cè)。每個(gè)濃度梯度設(shè)置5個(gè)平行組，計(jì)算實(shí)際濃度，比較實(shí)際濃度與理論濃度后得出方法回收率和變異系數(shù)，檢驗(yàn)準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d用同樣的方法配制并檢測(cè)質(zhì)控樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的日間精密度。結(jié)果顯示，本研究建立的兩性霉素B檢測(cè)方法回收率為98.79%～99.39%(RSD<3.00%), 提取回收率為98.50%～99.00%(RSD<3.00%), 日內(nèi)精密度、日間精密度RSD均<3.00%, 表明本法符合臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法學(xué)要求，見(jiàn)表3。

表3 兩性霉素B檢測(cè)方法的回收率和精密度

2.4 轉(zhuǎn)移穩(wěn)定性試驗(yàn)

2D-HPLC系統(tǒng)將目標(biāo)物從LC1轉(zhuǎn)移至LC2的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性用轉(zhuǎn)移回收率表示，將濃度為25 μg/mL的對(duì)照母液按照“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣體積為10 μL, 將得到的峰面積與LC2模式下單獨(dú)通過(guò)分析柱所得峰面積進(jìn)行比較，設(shè)置5個(gè)平行組，計(jì)算轉(zhuǎn)移回收率為99.96%,RSD為0.33%, 說(shuō)明2D-HPLC系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移回收率高且穩(wěn)定。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取高、中、低濃度的兩性霉素B質(zhì)控溶液各5份，不同處理(室溫放置24 h, 按照“1.3.3”質(zhì)控預(yù)處理后放置24 h, -80 ℃冷凍保存10 d, 反復(fù)凍融3次取出復(fù)溫)后，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，兩性霉素B的RSD均<4.00%, 準(zhǔn)確度為97.50%～103.50%, 表明室溫放置24 h、預(yù)處理后室溫放置24 h、冷凍10 d和反復(fù)凍融3次對(duì)兩性霉素B的測(cè)定結(jié)果均無(wú)影響，滿足臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)要求，見(jiàn)表4、表5。

表4 室溫放置24 h和預(yù)處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 反復(fù)凍融3次和-80 ℃保存10 d的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測(cè)

選取云南省傳染病醫(yī)院接受注射用兩性霉素B治療的真菌感染患者共計(jì)25例，給予維持劑量(15～30 mg/d)的兩性霉素B治療5 d后，于下次給藥前半小時(shí)采集患者靜脈血，按“1.3.3”方法處理樣本，并按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，兩性霉素B靜脈維持劑量為15～30 mg/d時(shí)，患者血漿谷濃度范圍為0.15～1.03 μg/mL, 見(jiàn)表6。

表6 25例真菌感染患者兩性霉素B血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 討 論

相關(guān)研究[7, 11]顯示，兩性霉素B在某些劑量下存在明顯的變異性，具有不可預(yù)測(cè)的非線性藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，因此有必要開(kāi)展TDM。目前，兩性霉素B的TDM多在特殊人群中開(kāi)展，如免疫缺陷患者、重癥感染患者、腎功能不全患者和兒童患者等[6-7], 同時(shí)也適用于對(duì)治療劑量(已知病原體對(duì)抗菌藥物的敏感性)反應(yīng)不佳的患者[5]。對(duì)于選用兩性霉素B治療真菌感染的患者而言，開(kāi)展TDM是非常必要的，可指導(dǎo)個(gè)性化給藥，改善治療效果。

2D-HPLC檢測(cè)系統(tǒng)具有在線凈化除雜功能，二維色譜柱可自動(dòng)化完成樣本的富集和凈化，避免傳統(tǒng)HPLC測(cè)定中因儀器靈敏度和色譜柱分離度的限制而需進(jìn)行繁雜前處理輔助樣本富集的操作，可提高樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和報(bào)告的及時(shí)性[12-14]。本研究建立的2D-HPLC兩性霉素B測(cè)

定方法是將分離機(jī)理不同且互相獨(dú)立的兩支色譜柱以串聯(lián)方式組合，并以自動(dòng)化的中間柱作為兩支色譜柱的轉(zhuǎn)移接口。與傳統(tǒng)HPLC相比, 2D-HPLC能顯著減少?gòu)?fù)雜樣本基質(zhì)效應(yīng)和殘留現(xiàn)象，大大提高樣本分離效率，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間及監(jiān)測(cè)成本等。本研究2D-HPLC系統(tǒng)的檢測(cè)器為高靈敏度二極管陣列檢測(cè)器，光程長(zhǎng)達(dá)85 mm, 可得到任意波長(zhǎng)的色譜圖，與HPLC的單通道檢測(cè)波長(zhǎng)相比，本方法可通過(guò)雙通道波長(zhǎng)測(cè)定濃度的比值來(lái)判斷干擾情況。

由于抗真菌藥物種類有限和真菌耐藥性的發(fā)展，目前，真菌感染仍是嚴(yán)重威脅公共健康的疾病之一[15]。兩性霉素B是抗真菌治療指南推薦的一線治療藥物[16], 開(kāi)展TDM可優(yōu)化兩性霉素B治療真菌感染的管理措施[17], 實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，在最大程度提高抗真菌效力與最小化藥物相關(guān)毒性方面達(dá)到平衡，從而提高臨床治療效果和藥學(xué)服務(wù)質(zhì)量。本研究建立的2D-HPLC兩性霉素B血藥濃度測(cè)定法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、自動(dòng)化程度高、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適用于臨床患者的兩性霉素B血藥濃度檢測(cè)，也為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供了一種穩(wěn)定而可靠的方法。