唐 煉, 孫 毅, 李 娟

(1. 長(zhǎng)江大學(xué), 湖北 荊州, 434100; 長(zhǎng)江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院, 2. 皮膚病與性病科,3. 全科醫(yī)學(xué)科, 湖北 荊州, 434100)

隱球菌是一種廣泛存在于周圍環(huán)境的機(jī)會(huì)致病菌，尤其是被鴿糞污染的土壤中[1], 其中人類可感染的隱球菌主要為新生隱球菌和格特隱球菌。隱球菌病最早于1894年被發(fā)現(xiàn)，目前已成為全球性分布的侵襲性真菌病(IFP)[2]。近年來(lái)，由于化療、器官移植免疫抑制治療的廣泛應(yīng)用和人類免疫缺陷病毒感染的流行，新生隱球菌的感染率明顯上升[3]。隨著新生隱球菌耐藥性的上升[4-5], 新生隱球菌感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年可造成100多萬(wàn)人感染和約60萬(wàn)人死亡[6], 因此臨床亟需探尋新的抗真菌藥物靶點(diǎn)。

噻苯達(dá)唑(TBZ)既是真核生物微管蛋白抑制劑(可破壞微管的定位和抑制其組裝)[7], 也是延胡索酸還原酶抑制劑(可影響真核細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化呼吸鏈)，理論上具有驅(qū)蟲(chóng)及抗真菌作用[8]。本研究參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)頒布的M27-A3方案，測(cè)定TBZ和抗真菌藥物氟康唑(FLU)、兩性霉素B(AMB)、泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VOR)單獨(dú)應(yīng)用對(duì)20株新生隱球菌臨床株的最低抑菌濃度(MIC)，并觀察TBZ分別聯(lián)合FLU、AMB、POS、ITR、VOR對(duì)新生隱球菌的體外協(xié)同抑菌效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株: 本研究選用荊州市中心醫(yī)院真菌實(shí)驗(yàn)室保存的20株新生隱球菌臨床株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，菌株均已進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，且實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前使用沙堡式瓊脂培養(yǎng)基活化2～3 d(37 ℃)。藥敏試驗(yàn)應(yīng)用近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株。

1.1.2 藥物: TBZ(批號(hào)148-79-8, 純度>99%)、AMB(批號(hào)1397-89-3, 純度≥98%)、POS(批號(hào)171228-49-2, 純度>99%)、FLU(批號(hào)86386-73-4, 純度>99%)、VOR(批號(hào)137234-62-9, 純度>99%)和ITR(批號(hào)84625-61-6, 純度>99%), 均購(gòu)自Selleck公司。將上述藥物用二甲亞砜(DMSO)配置并保存，濃度均為1 600 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 菌液和藥液制備: 參照CLSI M27-A3方案中推薦的方法配制培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)三氮嗎啡啉丙磺酸鈉緩沖(pH值7.0)的RPMI 1640液體培養(yǎng)液過(guò)濾滅菌。用無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液收集新生隱球菌孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子量為(1～5)×106CFU/mL, 然后用RPMI 1640 液體培養(yǎng)液稀釋1 000倍，最后得到的菌液濃度為(1～5)×103CFU/mL。TBZ用倍比稀釋法配制7個(gè)濃度梯度且濃度為0.5～32.0 μg/mL, FLU、POS、AMB、VOR和ITR用倍比稀釋法配制8個(gè)濃度梯度且濃度均為0.062 5～8.000 0 μg/mL。

1.2.2 藥敏試驗(yàn): 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤法，將菌液和2種藥物分別加入96孔培養(yǎng)板中[9]。首列(首行)第1孔作為生長(zhǎng)對(duì)照孔(無(wú)藥物孔)，第2～8行濃度依次遞增地加入TBZ 50 μL, 每行9孔，第2～9列濃度依次遞增加入1種抗真菌藥物50 μL, 每列8孔，再向生長(zhǎng)對(duì)照孔和有藥液的孔加入100 μL菌液，最后向第1列的1～8孔和第1行的1～9孔加入RPMI 1640液體培養(yǎng)液50 μL, 每1種菌液均使用5個(gè)96孔培養(yǎng)板，將TBZ分別與FLU、POS、AMB、VOR、ITR中的1種采用上述棋盤法操作后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 MIC測(cè)定和分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI)計(jì)算: 除AMB的MIC是與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比100%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低濃度外，其余藥物的MIC是與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比50%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低濃度，讀取各藥物單獨(dú)和聯(lián)合用藥時(shí)的MIC。FICI指聯(lián)合用藥時(shí)各藥MIC值除以單獨(dú)用藥時(shí)MIC值的商之和，即FICI=MICA聯(lián)合/MICA單獨(dú)+MICB聯(lián)合/MICB單獨(dú)。FICI<0.50為協(xié)同關(guān)系, 0.50～4.00為無(wú)關(guān), >4.00為拮抗關(guān)系。

2 結(jié) 果

本研究觀察TBZ和5種抗真菌藥物單獨(dú)應(yīng)用對(duì)新生隱球菌的MIC后發(fā)現(xiàn), TBZ對(duì)新生隱球菌菌株的MIC為8.0～32.0 μg/mL, 表明TBZ具有一定的抗新生隱球菌作用; 抗真菌藥物AMB、FLU、ITR、POS、VOR單獨(dú)應(yīng)用對(duì)新生隱球菌菌株的MIC分別為0.250 0～8.000 0、1.000 0～8.000 0、0.062 5～2.000 0、0.062 5～4.000 0、0.062 5～1.000 0 μg/mL,提示新生隱球菌對(duì)VOR最為敏感，對(duì)AMB、FLU的敏感性較低，見(jiàn)表1。

表1 TBZ和5種抗真菌藥物單獨(dú)應(yīng)用對(duì)20株新生隱球菌的體外抑菌效果

聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示, TBZ與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可將抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌的MIC降低2～4倍, TBZ與AMB聯(lián)合應(yīng)用對(duì)7株新生隱球菌有協(xié)同作用, TBZ與FLU聯(lián)合應(yīng)用對(duì)8株新生隱球菌有協(xié)同作用, TBZ與ITR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)4株新生隱球菌有協(xié)同作用, TBZ與POS聯(lián)合應(yīng)用對(duì)5株新生隱球菌有協(xié)同作用, TBZ與VOR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)1株新生隱球菌有協(xié)同作用，見(jiàn)表2。

表2 TBZ分別聯(lián)合5種抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌的體外抑菌效果

3 討 論

苯并咪唑化合物TBZ具有廣泛的生物活性，對(duì)多種胃腸道線蟲(chóng)及肺部、皮膚等組織內(nèi)寄生蟲(chóng)均有驅(qū)除效果。TBZ通過(guò)寄生蟲(chóng)類脂質(zhì)屏障被吸收，在蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)與微管蛋白結(jié)合，阻礙其進(jìn)一步聚合裝配成微管，進(jìn)而抑制寄生蟲(chóng)分泌顆粒和亞細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)[10]。相關(guān)研究[11]指出，新型微管相關(guān)cap-甘氨酸蛋白Cgp1控制新生隱球菌的生長(zhǎng)、分化和毒力，而TBZ可以影響微管的定位并抑制其組裝，此外Cgp1過(guò)表達(dá)菌株對(duì)TBZ的敏感性增加。TBZ還可以影響蟲(chóng)體的能量代謝，一方面抑制蟲(chóng)體對(duì)葡萄糖的攝取，導(dǎo)致糖原耗竭，另一方面抑制寄生性蠕蟲(chóng)延胡索酸還原酶活性，而后者的催化反應(yīng)是糖酵解過(guò)程不可或缺的環(huán)節(jié)，也是此類生物獲得能量的來(lái)源[12]。糖酵解受阻可使得三磷酸腺苷(ATP)生成減少，導(dǎo)致蟲(chóng)體代謝障礙，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗寄生蟲(chóng)作用。相關(guān)研究[13]證明，在真菌的生長(zhǎng)發(fā)育中，延胡索酸還原酶同樣起著關(guān)鍵作用，其通過(guò)影響真核細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化呼吸鏈而使菌體能量代謝失衡。在大多數(shù)已知的生物體中，延胡索酸還原酶是膜結(jié)合型，氧是線粒體呼吸鏈最重要的末端電子受體[14]。有氧呼吸鏈的主要功能是將質(zhì)子電轉(zhuǎn)出線粒體或細(xì)胞膜，以產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力，驅(qū)動(dòng) FoF1-ATP酶合成 ATP[15]。然而，微需氧環(huán)境中低等真核生物呼吸鏈相關(guān)研究[16-17]結(jié)果表明，線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-延胡索酸還原酶系統(tǒng)(延胡索酸呼吸)在無(wú)氧能量代謝中起重要作用。ENIAFE J等[18]指出，延胡索酸還原酶也可作為化療靶點(diǎn)在腫瘤治療中發(fā)揮作用。另有研究[19]證實(shí)，TBZ對(duì)白念珠菌、青霉菌等也具有抑制作用。

在致病性真菌感染中，新生隱球菌一直是除念珠菌屬以外最為常見(jiàn)的致病真菌，也是很常見(jiàn)的侵襲性真菌，嚴(yán)重危害患者健康，且致死率高[20]。AMB為多烯類抗生素，可與真菌胞膜上的固醇類結(jié)合，改變膜的通透性，使菌體破壞，起到殺菌作用，是目前治療新生隱球菌病的首選藥物之一[21]。臨床實(shí)踐指南[22]和專家共識(shí)[23]都建議首選AMB聯(lián)合氟胞嘧啶作為新生隱球菌病的誘導(dǎo)治療方案，病情穩(wěn)定后首選大劑量FLU作為鞏固期治療方案，或聯(lián)合氟胞嘧啶使用，也可單用AMB、ITR、VOR，或在此基礎(chǔ)上聯(lián)用氟胞嘧啶。隨著越來(lái)越多的臨床耐藥菌株的出現(xiàn)，有報(bào)道[24]稱新生隱球菌生物膜可明顯降低菌株對(duì)唑類藥物的敏感性。因此，尋找新的抗真菌靶點(diǎn)，增強(qiáng)新生隱球菌病的療效，已成為臨床迫切需求。本研究觀察結(jié)果顯示, TBZ單獨(dú)應(yīng)用具有一定的抗新生隱球菌作用，將TBZ分別與FLU、ITR、POS、VOR、AMB聯(lián)合應(yīng)用可降低這5種抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌的MIC, 其中TBZ聯(lián)合FLU或AMB的協(xié)同作用更好。值得注意的是，VOR是FLU的衍生物，對(duì)新生隱球菌的敏感性高，耐受性好[25], 但TBZ聯(lián)合VOR的協(xié)同效果并不明顯。

綜上所述，TBZ具有一定的抗新生隱球菌作用，在體外與常用抗真菌藥物FLU、ITR、POS、VOR、AMB聯(lián)用時(shí)可起到協(xié)同作用，降低抗真菌藥物對(duì)部分新生隱球菌菌株的MIC。本研究為TBZ的抗真菌作用提供了體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)，豐富了TBZ與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)新生隱球菌抑制作用的數(shù)據(jù)，未來(lái)可進(jìn)一步深入研究新生隱球菌呼吸鏈關(guān)鍵酶的作用機(jī)制，從而為抗真菌藥物新作用靶點(diǎn)的研究提供理論依據(jù)。此外，TBZ體外抗真菌效果與體內(nèi)抗真菌效果可能存在一定差異，故還需開(kāi)展更多的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證TBZ應(yīng)用于新生隱球菌感染治療中的可行性。