王雨心，孫瑞琪，劉堅(jiān)華，何偉娜

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)與生物信息學(xué)中心，上海 200025

癌癥是全球性重大公共衛(wèi)生問題，大部分癌癥患者確診即晚期，可選治療方法有限且預(yù)后不佳，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)［1-2］。因此，癌癥的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療至關(guān)重要［3］。腫瘤成像技術(shù)是癌癥診斷必不可少的工具。近年來，具備高時(shí)空分辨率和低生物毒性的熒光成像技術(shù)開始逐步應(yīng)用于在體成像領(lǐng)域。尤其是發(fā)射波長(zhǎng)位于700～1 000 nm的近紅外（near infrared，NIR）熒光成像技術(shù)，不但可以顯著避免生物組織自發(fā)熒光和光子散射的干擾，且具有優(yōu)越的組織穿透性，已成為腫瘤成像技術(shù)中的一大研究熱點(diǎn)［4-5］。

普通的熒光探針在體成像時(shí)始終保持熒光信號(hào)的發(fā)射，因此無法很好地將正常組織（如肝、腎等）與腫瘤組織區(qū)分開，易產(chǎn)生“假陽性”的結(jié)果。為了實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性成像，采用腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）響應(yīng)性熒光探針［6］是一個(gè)很有效的策略。腫瘤組織由于異常增殖、血液灌注不足及代謝失調(diào)，微環(huán)境組分發(fā)生改變，表現(xiàn)出乳酸增加、葡萄糖濃度降低、酸性升高、乏氧和免疫細(xì)胞募集等特征［7-10］。針對(duì)腫瘤組織間質(zhì)pH值為6.4～7.0，而正常組織間質(zhì)pH值為7.3～7.4這一差異，設(shè)計(jì)pH響應(yīng)性熒光探針，使其在酸性環(huán)境中顯示較強(qiáng)熒光，而在堿性環(huán)境中顯示較弱熒光，以實(shí)現(xiàn)腫瘤組織與正常組織的差別化成像，將極大地提高腫瘤成像的信噪比和精準(zhǔn)度。

目前，pH響應(yīng)性熒光探針的母核結(jié)構(gòu)大多為熒光素［11］、羅丹明［12］、氟硼吡咯［13］、萘酰亞胺［14］和花菁［15］等。其中，僅有花菁母核的吸收及發(fā)射波長(zhǎng)范圍位于NIR波段，在腫瘤成像研究領(lǐng)域備受關(guān)注［16-17］。花菁類熒光探針根據(jù)其所響應(yīng)的最佳pH范圍可分為2類：第一類探針響應(yīng)于酸性-微酸性（pH＜7.0）環(huán)境［15，18-20］，而第二類探針響應(yīng)于微酸性-中性（pH 6.4～7.4）環(huán)境［21-24］。其中，第二類探針對(duì)TME的響應(yīng)更加靈敏，更適用于腫瘤成像。但是，已報(bào)道的微酸性-中性響應(yīng)性花菁類探針普遍存在水溶性較差、缺少連接基團(tuán)等問題。因此，開發(fā)具有連接基團(tuán)、水溶性強(qiáng)、光學(xué)性能良好且pH響應(yīng)范圍與TME相符的花菁類熒光探針具有重要的研究意義。本研究擬合成水溶性pH響應(yīng)性花菁類近紅外熒光探針，并評(píng)估其光學(xué)性能，以期為該探針的腫瘤在體成像應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116 購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；6 周齡SPF 級(jí)BALB/c 雌性小鼠購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0001，使用許可證號(hào)SYXK（滬）2018-0031。

1.2 主要試劑和儀器

2-氯-3-（羥基亞甲基）-環(huán)己-1-烯甲醛（上海安米克化學(xué)品有限公司），1-（5-羧基己基）-2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸內(nèi)鹽、6-（2，3，3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基）乙酸溴化物（陜西金杰森茂生物科技有限公司），1-甲基哌嗪（TCI，日本），DMEM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），CCK-8試劑盒（Dojindo研究所，日本），Hoechst探針（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

pH 計(jì)（Mettler Toledo 公司，瑞士），CombiFlash?Rf200分離純化制備色譜儀（Teledyne公司，美國(guó)），1260高效液相色譜儀（Agilent公司，美國(guó)），高分辨率質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司，美國(guó)），超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀（Waters公司，美國(guó)），Avance Ⅲ400M核磁共振波譜儀（Bruker公司，德國(guó)），暗箱三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司），紫外-可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司），穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（Edinburgh公司，英國(guó)），EnSight多功能成像酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），Smart-LF 緊湊型小動(dòng)物熒光&生物發(fā)光成像系統(tǒng)（Vieworks公司，韓國(guó)）。

1.3 探針合成與結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 合成路線 在MYOCHIN等［24］合成的熒光探針（化合物1）的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)優(yōu)化合成路線（圖1）：在花菁類結(jié)構(gòu)的兩端吲哚氮原子上引入末端羧基修飾的長(zhǎng)碳鏈；同時(shí)在兩端吲哚芳環(huán)上引入磺酸基，構(gòu)建探針R2S（化合物7）。此外，相對(duì)應(yīng)的未引入磺酸基的探針R2Z（化合物8），作為對(duì)照也同時(shí)被合成。

圖1 探針R2S與R2Z的合成路線Fig 1 Synthetic routes of the target probes R2S and R2Z

1.3.2 化合物5的合成與純化 向10 mL 乙酸中加入化合物2 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸鈉（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光攪拌1 h。反應(yīng)后，溶液由深棕色轉(zhuǎn)變?yōu)槟G色。冷卻后，加入乙醚，靜置待析出沉淀。棄去上清液后，加入超純水溶解粗產(chǎn)物，通過C18柱層析進(jìn)行純化。用超純水/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分。減壓濃縮，冷凍干燥。

1.3.3 化合物6的合成與純化 向10 mL 乙酸中加入化合物3 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸鈉（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光攪拌1 h。反應(yīng)后，溶液由深棕色轉(zhuǎn)變?yōu)槟G色。冷卻后，加入乙醚，靜置待析出沉淀。棄去上清液后，加入二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，通過硅膠柱層析進(jìn)行純化。以二氯甲烷/甲醇（體積比20∶1）混合液為洗脫劑，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分，減壓濃縮，真空干燥。

1.3.4 R2S 的合成與純化 向10 mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）中加入化合物5（0.84 g，1.0 mmol）和1-甲 基 哌 嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氬氣保護(hù)下，避光攪拌4 h。反應(yīng)后，溶液由墨綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色。冷卻后，減壓干燥，加入超純水溶解粗產(chǎn)物，通過C18柱層析進(jìn)行純化。采用超純水/甲醇對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分。減壓濃縮，冷凍干燥。

1.3.5 R2Z 的合成與純化 向10 mL DMF 中加入化合物6（0.68 g，1.0 mmol）和1-甲基哌嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氬氣保護(hù)下，避光攪拌4 h。反應(yīng)后，溶液由墨綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色。冷卻后，減壓干燥，加入二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，通過硅膠柱層析進(jìn)行純化。以二氯甲烷/甲醇（體積比20∶1）混合液為洗脫劑，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分，減壓濃縮，真空干燥。

1.3.6 化合物的結(jié)構(gòu)表征 對(duì)于純化后獲得的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，均通過質(zhì)譜（mass spectroscopy，MS） 確定相對(duì)分子質(zhì)量，通過磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）鑒定結(jié)構(gòu)，通過分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography， HPLC） 檢 測(cè)純度。

1.4 光譜學(xué)特性表征

取R2S、R2Z 分別溶于不同pH 值的磷酸鹽緩沖液（sodium phosphate buffer，PBS），用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行吸收光譜檢測(cè)，穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀進(jìn)行發(fā)射光譜檢測(cè)。

基于發(fā)射光譜，讀取探針R2S、R2Z 在質(zhì)子化狀態(tài)下最大發(fā)射波長(zhǎng)（λEmmax）處對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度數(shù)值（Imax），及不同pH 條件下探針于相應(yīng)λEmmax處的熒光強(qiáng)度I，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度（I/Imax），繪制探針的相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)pH 值的響應(yīng)曲線。在曲線上讀取ΔI/Imax中值處對(duì)應(yīng)的pH數(shù)值，即探針的酸解離常數(shù)（pKa）。

1.5 pH響應(yīng)可逆性測(cè)試

取R2S、R2Z 分別溶于pH 3.68 的PBS，檢測(cè)其吸收光譜；隨后，滴加氫氧化鈉溶液，將待測(cè)溶液的pH 值調(diào)至10.31，檢測(cè)其吸收光譜；再滴加磷酸溶液將待測(cè)溶液pH 值調(diào)至3.68，檢測(cè)其吸收光譜；最后，滴加氫氧化鈉溶液，將待測(cè)溶液的pH 值調(diào)至10.31，再次檢測(cè)其吸收光譜。

1.6 穩(wěn)定性評(píng)估

1.6.1 光穩(wěn)定性 取R2Z、R2S 分別溶于pH 4.48 和pH 9.47 的PBS，置于紫外光下持續(xù)照射，分別于第10、30、60 和120 min 時(shí)，檢測(cè)各探針溶液的發(fā)射光譜。評(píng)估R2S、R2Z 在不同pH 條件下的光穩(wěn)定性，并比較同一pH條件下R2S和R2Z的光穩(wěn)定性差異。

1.6.2 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 將完成吸收光譜檢測(cè)的樣品于37 ℃下避光放置，分別于第6、12和24 h時(shí)，檢測(cè)各探針溶液的吸收光譜。評(píng)估R2S、R2Z 在不同pH 條件下的穩(wěn)定性，同時(shí)比較同一pH 條件下R2S 和R2Z的穩(wěn)定性差異。

1.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞和人宮頸癌HeLa 細(xì)胞，接種于96 孔板繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的探針溶液或溶劑，孵育24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，并用PBS 洗滌2次，加入含有CCK-8 的培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔樣品溶液在450 nm處的吸光度值。

1.8 細(xì)胞膜通透性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后加入10 μmol/L 探針溶液，孵育2 h 后，用PBS 洗滌2 次。加入含有10 μg/mL Hoechst 的培養(yǎng)基孵育10 min，用PBS 洗滌2 次后，換新鮮培養(yǎng)基。在激光共聚焦顯微鏡下分別采用633 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，收集700～800 nm 通道下的熒光信號(hào)來觀測(cè)合成探針的成像情況，以及采用405 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，收集430～470 nm 通道下的熒光信號(hào)來觀測(cè)探針Hoechst的顯像，輔助亞細(xì)胞定位。

1.9 NIR成像實(shí)驗(yàn)

1.9.1 體外NIR 成像 在48 孔板中，依次加入20 μmol/L 不同pH（6.00、6.50、7.00、7.50 和8.00）的探針溶液，采用740～790 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，收集810～860 nm通道下的熒光信號(hào)。

1.9.2 小動(dòng)物NIR 成像初步探索 取2 只6 周齡BALB/c 雌性小鼠，通過尾靜脈分別注射10 μmol/L的R2S 和R2Z 探針溶液，于 第10 min、1 h、4 h、20 h、24 h進(jìn)行活體成像。

參考SHI 等［25］的方法，取1 只6 周齡BALB/c 雌性小鼠，于其背部左側(cè)和右側(cè)分別皮下注射pH 6.50和pH 7.40 的PBS，5 min 后在對(duì)應(yīng)部位分別注射50 μmol/L的R2S探針溶液，進(jìn)行活體成像。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采 用Microsoft Excel、 GraphPad Prism 7.0 或Origin 2021 軟件處理相應(yīng)數(shù)據(jù)。采用GraphPad Prism 7.0 軟件計(jì)算pKa和分析數(shù)據(jù)之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物5 為墨綠色固體，其分子結(jié)構(gòu)（圖1）通過1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）進(jìn)行鑒定，各峰的化學(xué)位移δ（峰型，耦合常數(shù)J，氫的數(shù)目）為：12.02 （寬峰，2H），8.25 （雙重峰，J=14.0 Hz，2H），7.80（單峰，2H），7.64（雙重峰，J=8.4 Hz，2H），7.44（雙重峰，J=8.4 Hz，2H），6.33（雙重峰，J=14.4 Hz，2H），4.21 （三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.67（單峰，12H），1.56（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。分子量通過MS（ESI+）測(cè)試進(jìn)行驗(yàn)證： 化學(xué)式為C42H50ClN2O10S2，［M+2H］+m/z理論值為843.26，測(cè)定值為843.36。

化合物6 為墨綠色固體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結(jié)果：δ 11.99（寬峰，2H），8.26（雙重峰，J=14.0 Hz，2H），7.64（雙重峰，J=7.6 Hz，2H），7.44（多重峰，4H），7.29（三重峰，J=7.2 Hz，2H），6.32（雙重峰，J=14.4 Hz，2H），4.22（三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=5.6 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.68（單峰，12H），1.55（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學(xué)式為C42H52ClN2O4，［M］+m/z理論值為683.36，測(cè)定值為683.41。

化 合 物7 （R2S） 為 深 藍(lán) 色 固 體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結(jié)果：δ 7.68（單峰，2H），7.59（多重峰，4H），7.18（雙重峰，J=8.0 Hz，2H），5.95（雙重峰，J=12.8 Hz，2H），4.03（多重峰，4H），3.74（多重峰，4H），3.16（多重峰，4H），3.06（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（多重峰，7H），1.72（多重峰，6H），1.63（單峰，12H），1.54（多重峰，4H），1.35（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學(xué)式為C47H61N4O10S2，［M+2H］+m/z理論值為907.38，測(cè)定值為907.54。根據(jù)分析型HPLC峰面積檢測(cè)化合物純度為95.7%。

化 合 物8 （R2Z） 為 深 藍(lán) 色 固 體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結(jié)果：δ 7.58（雙重峰，J=12.8 Hz，2H），7.51（雙重峰，J=7.2 Hz，2H），7.32（三重峰，J=7.8 Hz，2H），7.22（雙重峰，J=7.6 Hz，2H），7.11（三重峰，J=7.6Hz，2H），5.90（雙重峰，J=13.2 Hz，2H），3.99（多重峰，4H），3.72（多重峰，4H），2.61（多重峰，4H），2.46（多重峰，4H），2.33（單峰，3H），2.06（三重峰，J=5.8 Hz，4H），1.68（多重峰，2H），1.57（多重峰，16H），1.35（多重峰，4H），1.24（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學(xué)式為C47H63N4O4，［M］+m/z理論值為747.48，測(cè)定值為747.46。根據(jù)分析型HPLC峰面積檢測(cè)化合物純度為92.8%。

2.2 探針的pH響應(yīng)性檢測(cè)

通過對(duì)比在不同pH條件下探針溶液的吸收光譜和發(fā)射光譜，可以發(fā)現(xiàn)R2S、R2Z探針均具有明顯的pH響應(yīng)性。隨著溶液酸性逐漸增強(qiáng)（從pH 11.10 到pH 3.47），R2S 和R2Z 的最大吸收波長(zhǎng)（λAbsmax）分別由642 nm和662 nm紅移至774 nm和760 nm（圖2A、B），吸光度均明顯增強(qiáng)。同時(shí)，R2S和R2Z的λEmmax分別由794 nm和790 nm紅移至808 nm和804 nm（圖2C、D），且熒光強(qiáng)度也均有明顯升高。計(jì)算可得，R2S的斯托克斯位移（Stokes shift，即λEmmax和λAbsmax之間的差值）為64 nm，高于R2Z的斯托克斯位移44 nm（表1），說明R2S成像時(shí)發(fā)射光與激發(fā)光更易分辨，進(jìn)而可更大程度地排除激發(fā)光的干擾。

表1 R2S與R2Z的光學(xué)參數(shù)Tab 1 Spectroscopic parameters of probes R2S and R2Z

圖2 R2S與R2Z在不同pH值下的吸收光譜及熒光光譜Fig 2 Absorption spectra and fluorescence spectra of the probes R2S and R2Z at different pH values

通過探針R2S、R2Z 相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)pH 值的響應(yīng)曲線（圖3），得到探針的pKa值分別為6.88、7.05，可以看出兩者對(duì)微酸性-中性環(huán)境（pH 6.4～7.4）的變化反應(yīng)靈敏，最佳響應(yīng)范圍與腫瘤所處環(huán)境相符，屬第二類pH響應(yīng)性熒光探針。通過pH響應(yīng)曲線的斜率求得，R2S 的pH 響應(yīng)靈敏度數(shù)值為0.361 7，明顯高于R2Z（0.274 3）。

圖3 R2S與R2Z在不同pH值下的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig 3 Relative fluorescence intensity of probes R2S and R2Z upon different pH values

2.3 探針的pH響應(yīng)可逆性及穩(wěn)定性

作為理想的pH 響應(yīng)性探針，除了需要具有良好的光學(xué)性能，還需要具有較好的pH響應(yīng)可逆性及穩(wěn)定性。通過吸收光譜檢測(cè)探針的pH響應(yīng)可逆性，無論是將探針溶液由酸性調(diào)至堿性，還是由堿性調(diào)至酸性，R2S的吸收光譜變化在3個(gè)pH變化周期內(nèi)都是完全可逆的（圖4A）。但是R2Z僅表現(xiàn)出部分可逆性，當(dāng)溶液pH由3.68調(diào)至10.31時(shí)，R2Z的吸收光譜在760 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰（圖4B），說明有新的物質(zhì)生成。為了更好地評(píng)估探針在體溫（37 ℃）、不同pH條件的穩(wěn)定性，采用熒光發(fā)射光譜檢測(cè)探針的光穩(wěn)定性，采用吸收光譜檢測(cè)探針的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖4C、D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)R2Z在堿性（pH 9.47）條件下較為穩(wěn)定，但在酸性（pH 4.48）條件下穩(wěn)定性欠佳，而R2S無論在酸性和堿性條件下都顯示出了較高的穩(wěn)定性。

圖4 R2S與R2Z的pH響應(yīng)可逆性和穩(wěn)定性Fig 4 Reversible changes toward cyclically adjusted pH and stabilities of probes R2S and R2Z

2.4 探針的細(xì)胞毒性評(píng)估

采用細(xì)胞（HCT-116細(xì)胞、HeLa細(xì)胞）毒性實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)R2S與R2Z探針的安全性。對(duì)比R2S高濃度給藥組（100 μmol/L）與未給藥組，2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5A、C），說明探針對(duì)2種細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，具有良好的安全性。而應(yīng)用R2Z處理HCT-116細(xì)胞，給藥濃度為50 μmol/L時(shí)，與未給藥組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007，圖5B）；處理HeLa細(xì)胞，給藥濃度為6.25 μmol/L時(shí)，與未給藥組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，圖5D）。R2Z給藥組在工作濃度（12.5 μmol/L）時(shí)，細(xì)胞相對(duì)存活率已降至80%以下，說明該探針的安全性低于R2S。

圖5 R2S與R2Z對(duì)HCT-116細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的毒性Fig 5 Cytotoxicity evaluation in HCT-116 and HeLa cells of probes R2S and R2Z

2.5 探針的細(xì)胞膜通透性測(cè)試

通過激光共聚焦顯微成像可在633 nm 通道下觀測(cè)到探針發(fā)出的熒光信號(hào)。對(duì)比R2S、R2Z 探針和Hoechst 發(fā)射熒光區(qū)域分布的異同，可以發(fā)現(xiàn)R2S 和R2Z 探針均主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖6），表明2 種合成探針均具有良好的細(xì)胞膜通透性。

圖6 R2S與R2Z的HeLa細(xì)胞成像Fig 6 Imaging of probes R2S and R2Z in HeLa cells

2.6 探針用于模擬TME的在體成像

使用小動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)在48 孔板中不同pH 條件下探針溶液的成像差異。在pH 6.00～8.00 范圍內(nèi)，R2S、R2Z 探針的熒光強(qiáng)度均隨著pH 值的降低而升高，說明兩者均具有較好的pH 響應(yīng)性，且可觀察到R2S的熒光強(qiáng)度高于R2Z（圖7A～C）。

注射熒光探針的實(shí)驗(yàn)組小鼠飲食、活動(dòng)正常，與未注射熒光探針的對(duì)照組小鼠狀態(tài)無異?；铙w和離體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R2S 主要分布于肝臟和腎臟，而R2Z 主要分布于肝臟（圖7D）。在小鼠背部皮下注射pH 6.50 和pH 7.40 的PBS，模擬腫瘤和正常組織的微環(huán)境，隨后注入R2S 后進(jìn)行熒光成像（圖7E）。在檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)pH 6.50側(cè)的熒光強(qiáng)度明顯高于pH 7.40側(cè)（圖7F），表明R2S 在模擬TME 的低pH 組織和正常pH組織中的成像具有明顯的區(qū)分度。

圖7 R2S與R2Z的體外與體內(nèi)NIR成像Fig 7 In vitro and in vivo NIR imaging of probes R2S and R2Z

3 討論

熒光基團(tuán)經(jīng)特定波段的激發(fā)光照射后，電子吸收光能躍遷至激發(fā)態(tài)后不穩(wěn)定，隨即返回基態(tài)并發(fā)射另一波長(zhǎng)（通常為更大波長(zhǎng)）的光，產(chǎn)生熒光信號(hào)。連有熒光基團(tuán)的探針分子可以與被測(cè)物質(zhì)相結(jié)合，借助光學(xué)成像手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物質(zhì)的定性及定量分析。在眾多不同結(jié)構(gòu)的熒光基團(tuán)中，花菁類熒光基團(tuán)可通過改變其結(jié)構(gòu)中共軛鏈的長(zhǎng)度將其發(fā)射光譜范圍拓展至NIR波段，非常適合用于腫瘤成像。然而，大多數(shù)已報(bào)道［18，21-22］的花菁類熒光探針穩(wěn)定性欠佳，水溶性亦有待提高，同時(shí)其對(duì)腫瘤的選擇性有限，且成像過程中正常組織的背景信號(hào)過高。上述問題大大限制了花菁類熒光探針的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

在本研究中，我們合成得到了純度90%以上的水溶性pH 響應(yīng)性花菁類NIR 熒光探針R2S。通過光譜學(xué)和NIR 成像檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)探針R2S 對(duì)微酸性-中性環(huán)境具有較好的pH響應(yīng)性。正如所設(shè)計(jì)的那樣，相較于R2Z，由于探針R2S中引入了磺酸基，其水溶性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞毒性明顯降低，且仍保留了良好的細(xì)胞通透性。

此外，我們發(fā)現(xiàn)探針R2S在光學(xué)性能、穩(wěn)定性和pH 響應(yīng)可逆性方面，皆大大優(yōu)于其脂溶性類似物R2Z。首先，在R2S 結(jié)構(gòu)中，吲哚環(huán)上磺酸基的引入可使探針?biāo)苄缘靡栽鰪?qiáng)，而分子間堆積作用相應(yīng)減弱，J 聚集體減少，Stokes 位移增大，量子產(chǎn)率增強(qiáng)［26-27］。其次，據(jù)我們推測(cè)，磺酸基的引入增大了單線態(tài)氧進(jìn)攻的空間位阻，降低了單線態(tài)氧的進(jìn)攻可能性［28］，使R2S展現(xiàn)出更為優(yōu)異的光穩(wěn)定性。此外，磺酸基是吸電子基團(tuán)，將其引入至共軛結(jié)構(gòu)中，可使共軛體系電子云密度下降，從而減少氫質(zhì)子對(duì)化合物的親電進(jìn)攻，使探針R2S在酸性條件下的穩(wěn)定性大大改善，而pH響應(yīng)可逆性亦得以提升。

生物安全性和腫瘤特異性是腫瘤成像探針的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。尾靜脈注射探針R2S 后，小鼠行為正常，與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同證明探針具有較高的安全性。而通過皮下注射不同pH 的緩沖溶液來模擬“腫瘤組織”和“正常組織”微環(huán)境，原位注射探針R2S后的NIR成像結(jié)果表明“腫瘤組織”（低pH區(qū)域）呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明該探針對(duì)腫瘤微酸性環(huán)境具有較好的特異響應(yīng)性。綜合以上兩方面，該探針展現(xiàn)出應(yīng)用于腫瘤成像的廣闊前景。

在我們的設(shè)計(jì)中，R2S 探針的末端羧基提供了2個(gè)連接位點(diǎn)，可偶聯(lián)靶向肽［29］、納米顆粒［30］或其他分子，通過主動(dòng)靶向或?qū)嶓w瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR），進(jìn)一步加劇探針在腫瘤組織處富集，在TME特異性成像的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高腫瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度及腫瘤成像的信噪比，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)成像及癌癥的精確診斷。

總之，本研究構(gòu)建了一種性能優(yōu)良的水溶性pH響應(yīng)性花菁類NIR 熒光探針R2S。探針R2S 對(duì)pH 變化響應(yīng)靈敏、穩(wěn)定，最佳響應(yīng)范圍與腫瘤所處微環(huán)境的pH 相符，且水溶性佳、穩(wěn)定性高、安全性好、具備共價(jià)標(biāo)記的連接基團(tuán)。該探針在腫瘤成像領(lǐng)域展現(xiàn)出了較強(qiáng)的在體成像應(yīng)用潛力，為NIR熒光探針的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供了新的思路和工具。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)A2018027）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的條例進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by the Laboratory Animal Ethics and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University （Approval Letter No. A2018027），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of theImplementation Rules for the Management of Medical Laboratory Animals.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

劉堅(jiān)華、何偉娜、王雨心和孫瑞琪參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；王雨心和孫瑞琪參與了化學(xué)合成、純化和結(jié)構(gòu)驗(yàn)證；王雨心進(jìn)行了光譜測(cè)試、細(xì)胞毒性測(cè)試、成像實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析；王雨心、何偉娜、劉堅(jiān)華參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Jianhua，HE Weina，WANG Yuxin and SUN Ruiqi. WANG Yuxin and SUN Ruiqi carried out the chemical synthesis，purification and structural verification.WANG Yuxin performed the spectroscopy test，cytotoxicity study，imaging experiments and data analysis.The manuscript was drafted and revised by WANG Yuxin，HE Weina and LIU Jianhua.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-19

·Accepted：2022-06-25

·Published online：2022-07-28