丁 賀，曹楊琳，何 楊，魏 星，楊劍峰

1.蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院唐仲英醫(yī)學(xué)研究院血液學(xué)研究中心，蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省血液研究所，蘇州 215006；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，蘇州 215006

臨床上，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）常表現(xiàn)為惡性漿細(xì)胞在骨髓中的克隆性增生，是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。大多數(shù)MM患者的異常漿細(xì)胞可表達(dá)單克隆免疫球蛋白（也稱M 蛋白）。研究［2］顯示，MM 可損害相關(guān)終末器官，導(dǎo)致高鈣血癥、腎功能不全、貧血和骨質(zhì)破壞等。近20年來，自體造血干細(xì)胞移植、新型治療藥物的開發(fā)以及CAR-T細(xì)胞治療、雙特異抗體等新興免疫療法的應(yīng)用已顯著改善了MM患者的治療效果，但由于其耐藥、復(fù)發(fā)等因素使得絕大多數(shù)患者仍不能完全被治愈［3-6］。因此，繼續(xù)深入探索MM的發(fā)病機(jī)制及其新的治療策略是臨床亟待解決的一大問題。

Sma 和Mad 相 關(guān) 蛋 白7 （Sma- and Mad-related protein 7，SMAD7）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路的重要抑制性分子，在多種實(shí)體瘤（如胃癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌等）中參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥等［7-9］。目前，SMAD7 在MM 中的表達(dá)及在骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能尚未被研究報(bào)道。基于此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析，檢測(cè)健康捐獻(xiàn)者和MM 患者的骨髓CD138+細(xì)胞中SMAD7mRNA的相對(duì)表達(dá)，并通過體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SMAD7 對(duì)MM 細(xì)胞增殖、耐藥的影響，從而為MM的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及分析

從基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中下載MM數(shù)據(jù)集GSE5900、GSE6477、GSE13591。GSE5900 數(shù)據(jù)集包含22 例健康捐獻(xiàn)者、44 例意義未明單克隆丙種球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS） 和12 例冒煙型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM）的數(shù)據(jù)，分析SMAD7在健康捐獻(xiàn)者和進(jìn)展為MM的2個(gè)前期階段（即MGUS、SMM） 中的表達(dá)差異。GSE6477數(shù)據(jù)集包含15例健康捐獻(xiàn)者、22例MGUS、24例SMM和73例新診斷MM的數(shù)據(jù)，分析SMAD7在該病例中的差異表達(dá)。GSE13591數(shù)據(jù)集包含5例健康捐獻(xiàn)者、11例MGUS、133例MM和9例漿細(xì)胞白血?。╬lasma cell leukemia，PCL）的數(shù)據(jù)，分析SMAD7在該病例中的差異表達(dá)。GEO數(shù)據(jù)庫提取的SMAD7表達(dá)數(shù)據(jù)均采用R4.0.1軟件進(jìn)行分析。

1.2 標(biāo)本收集、臨床資料獲取及分析

選擇2021年6月—2022年3月于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科的8例健康捐獻(xiàn)者和20例MM患者。收集健康捐獻(xiàn)者及MM患者的骨髓穿刺標(biāo)本。同時(shí)，從醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)獲取MM患者的臨床資料，包括年齡、性別、漿細(xì)胞比例、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、肌酐（creatinine，Cr）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、骨質(zhì)破壞情況，分析SMAD7mRNA相對(duì)表達(dá)與患者臨床資料的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞和主要試劑

人骨髓瘤細(xì)胞KMS11和人胚腎細(xì)胞293T均由蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院唐仲英醫(yī)學(xué)研究院血液學(xué)研究中心保存。

人淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，人CD138+磁性微珠購自德國Miltenyi公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 標(biāo) 簽 的pReceiver-Lv215慢病毒空載體質(zhì)粒（Vector）和pReceiver-Lv215-SMAD7慢病毒重組質(zhì)粒（Lv-SMAD7）均購自廣州復(fù)能基因有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，SMAD7 抗體購自美國GeneTex 公司，GAPDH抗體均購自美國ProteinTech公司，CCK8試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，硼替佐米購自美國Selleck公司。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本處理 向骨髓穿刺標(biāo)本中加入等體積0.9%NaCl溶液，以重懸、混勻。將該混合液沿管壁緩慢加入含淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫下500×g離心30 min。隨后，吸取含淋巴細(xì)胞的白膜層細(xì)胞置于潔凈離心管中，并向其中加入等體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），于300×g離心10 min。棄上清液后用1 mL PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，向每2×107個(gè)細(xì)胞中加80 μL 緩沖液及20 μL CD138 磁珠，混勻后于4 ℃避光孵育15 min，最后于MACS磁珠分選器的MS 分選柱中進(jìn)行分選，以獲得CD138+細(xì)胞。

1.4.2 標(biāo)本骨髓CD138+細(xì)胞中SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）檢測(cè)SMAD7mRNA 的相對(duì)表達(dá)。TRIzol 法提取經(jīng)磁珠分選的CD138+細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 后，利用SYBR?qPCR Master Mix 反應(yīng)體系和StepOne real-time PCR 儀進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。具體反應(yīng)條件參照說明書進(jìn)行。采用2-ΔΔCT法 分 析SMAD7mRNA 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量，以GAPDH為相對(duì)內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng) 于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)KMS11 細(xì)胞，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T 細(xì)胞。每隔2～3 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 慢病毒包裝 將293T 細(xì)胞以4×106個(gè)/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用慢病毒包裝試劑盒將質(zhì)粒Vector、Lv-SMAD7分別與包裝質(zhì)粒和293T 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染14～16 h，而后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。

1.4.5 慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定過表達(dá)SMAD7的細(xì)胞株建立 將KMS11細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，向其中分別加入上述慢病毒上清液進(jìn)行感染，并添加終濃度為5 μg/mL 聚凝胺提高感染效率。感染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。同時(shí)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)2×106個(gè)時(shí)，采用流式細(xì)胞分選儀分選GFP+細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的KMS11 細(xì)胞。而后，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證轉(zhuǎn)染KMS11 細(xì)胞中SMAD7 的表達(dá)效果，以建立穩(wěn)定過表達(dá)SMAD7的KMS11細(xì)胞株。

1.4.6 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染Vector 或Lv-SMAD7的KMS11 細(xì)胞分別按照3×103個(gè)/孔接種至96孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)0、1、2、4 d。而后，向每孔加入10 μL CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的D（450 nm）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.7 細(xì)胞周期分布檢測(cè) 分別收集轉(zhuǎn)染Vector 和Lv-SMAD7的KMS11 細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 進(jìn)行洗滌，棄盡上清液。用1 mL 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，并向其中輕輕地邊渦旋邊逐滴滴加3 mL 預(yù)冷的無水乙醇溶液直至其終濃度為75%，遂于-20 ℃下對(duì)細(xì)胞固定過夜。次日，用PBS 洗滌細(xì)胞后，向其中加入400 μL PI 染色液，于37 ℃染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期分布。

1.4.8 硼替佐米藥物處理后的細(xì)胞活力檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染Vector或Lv-SMAD7的KMS11 細(xì)胞分別按照8×103個(gè)/孔接種于96孔板，向其中添加硼替佐米藥物至終濃度分別為0、20、40、60、80 nmol/L，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。而后，向每孔添加15 μL CCK8 試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀檢測(cè)D（450 nm）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.9 硼替佐米藥物處理后的細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染Vector或Lv-SMAD7的KMS11細(xì)胞分別按3×105個(gè)/孔接種到6 孔板，并添加終濃度為40 nmol/L 的硼替佐米藥物，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并使用細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行染色，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。對(duì)于符合正態(tài)分布的定量資料以±s表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間比較。對(duì)于不符合正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫中與MM相關(guān)的SMAD7表達(dá)分析

對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索獲取的3 個(gè)數(shù)據(jù)集中的SMAD7表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：GSE5900數(shù)據(jù)集中，MM患者的2個(gè)前期階段MGUS、SMM相較于健康捐獻(xiàn)者，其SMAD7表達(dá)均較高（均P=0.000，圖1A）；GSE6477數(shù)據(jù)集中，新診斷MM患者的SMAD7表達(dá)較健康捐獻(xiàn)者有所上調(diào)（P=0.001，圖1B）；GSE13591 數(shù)據(jù)集中，MM、PCL 患者較健康捐獻(xiàn)者，其SMAD7表達(dá)均有上調(diào)（均P＜0.05，圖1C）。

圖1 GSE5900（A）、GSE6477（B）、GSE13591（C）數(shù)據(jù)集中與MM相關(guān)的SMAD7的表達(dá)分析Fig 1 Expression analysis of SMAD7 associated with MM in the GSE5900(A),GSE6477(B)and GSE13591(C)datasets

2.2 SMAD7 mRNA 在健康捐獻(xiàn)者及MM 患者中的相對(duì)表達(dá)

為進(jìn)一步分析SMAD7在MM 患者中的表達(dá)情況，本研究采用qPCR 分析8 例健康捐獻(xiàn)者及20 例MM 患者骨髓CD138+細(xì)胞中SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果（圖2）顯示，MM 患者SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)水平較健康捐獻(xiàn)者有所升高（P=0.002）。

圖2 SMAD7 mRNA 在健康捐獻(xiàn)者及MM 患者的骨髓CD138+細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)Fig 2 Relative expression of SMAD7 mRNA in bone marrow CD138+cells from healthy donors and MM patients

2.3 SMAD7 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平與MM 患者臨床資料的關(guān)系

對(duì)20 例MM 患者的臨床資料與SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，在患者的性別、年齡、漿細(xì)胞比例、Hb 水平、Cr 水平、LDH水平、骨質(zhì)破壞情況等指標(biāo)中，SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)水平間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SMAD7 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與MM患者臨床資料的關(guān)系Tab 1 Relationship between the relative expression of SMAD7 mRNA and clinical information of patients with MM

2.4 SMAD7對(duì)KMS11細(xì)胞增殖的影響

為評(píng)估SMAD7 在MM 發(fā)生與發(fā)展中的生物學(xué)功能， 本研究分別向KMS11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Vector、Lv-SMAD7，并采用Western blotting 進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)果（圖3A）發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染Vector 后的細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染Lv-SMAD7后的KMS11 細(xì)胞中SMAD7 的表達(dá)顯著升高，即成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)SMAD7 的KMS11 細(xì)胞株。

接著， 采用CCK8 法檢測(cè)分別經(jīng)Vector、Lv-SMAD7轉(zhuǎn)染的KMS11 細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果（圖3B）顯示，與Vector 組細(xì)胞相比， Lv-SMAD7組細(xì)胞在接種后1、2、4 d 的活力均較高（均P＜0.05）。而后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Vector 組和Lv-SMAD7組細(xì)胞的周期分布，探究SMAD7對(duì)細(xì)胞周期的影響；結(jié)果（圖3C）顯示，Vector組和Lv-SMAD7組細(xì)胞的G0/G1期比例分別為（34.9±1.0）%、（32.3±1.9）%，而S期比例［（59.7±0.5）%vs（57.7±0.7）%］及G2/M 期比例［（5.4±0.8）%vs（10.0±1.3）%］組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖3 SMAD7對(duì)KMS11細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of SMAD7 on proliferation of KMS11 cells

2.5 SMAD7 對(duì)經(jīng)硼替佐米處理的KMS11 細(xì)胞耐藥的影響

采用不同濃度的硼替佐米分別處理經(jīng)Vector 或Lv-SMAD7轉(zhuǎn)染的KMS11細(xì)胞，而后利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的D（450 nm）并計(jì)算存活率。結(jié)果（圖4A）顯示，在20、40、60、80 nmol/L硼替佐米的作用下，Lv-SMAD7組細(xì)胞的存活率均高于Vector 組（均P=0.000）。繼而提示，過表達(dá)SMAD7 可降低KMS11 細(xì)胞對(duì)硼替佐米的藥物敏感性。隨后，根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取40 nmol/L 的硼替佐米（細(xì)胞凋亡率在20%～30%），處 理 經(jīng)Vector 或Lv-SMAD7轉(zhuǎn) 染 的KMS11 細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果（圖4B）顯示，Lv-SMAD7組細(xì)胞的凋亡水平低于Vector組。

圖4 SMAD7對(duì)經(jīng)硼替佐米處理的KMS11細(xì)胞耐藥的影響Fig 4 Effects of SMAD7 on resistance of KMS11 cells treated with bortezomib

3 討論

目前，MM 的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，雖然新型藥物及治療策略的應(yīng)用已顯著提高了患者的治療反應(yīng)率、無進(jìn)展生存率和總生存率，但絕大多數(shù)MM患者仍面臨耐藥和復(fù)發(fā)的問題［6］。因此，尋找新的分子靶點(diǎn)以及為治療MM 提供新的理論基礎(chǔ)具有重要意義。

本研究借助生物信息數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，SMAD7在MM 中表達(dá)上調(diào)。隨后，我們收集了8 例健康捐獻(xiàn)者及20 例MM 患者的骨髓標(biāo)本，qPCR 檢測(cè)骨髓CD138+細(xì)胞中SMAD7mRNA 的相對(duì)表達(dá)，并分析其與患者臨床資料的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康捐獻(xiàn)者相比，MM 患者SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)較高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而SMAD7mRNA 相對(duì)表達(dá)與患者的臨床資料間無顯著相關(guān)性，究其原因，可能與樣本量較小有關(guān)。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SMAD7 具有調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、耐藥等功能。SEHRAWAT 等［10］報(bào)道，條件性敲除小鼠胰腺β細(xì)胞的SMAD7后，β細(xì)胞的增殖受到抑制，提示SMAD7可促進(jìn)細(xì)胞增殖。KLEEFF 等［11］研究表明，約有50%的胰腺癌患者的SMAD7mRNA水平較高，可消除胰腺癌細(xì)胞中TGF-β1 的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，從而增強(qiáng)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。此外，SMAD7的泛素降解可激活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的TGF-β 途徑，并參與膠質(zhì)瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和化學(xué)治療（化療）耐藥［12］。

本研究通過構(gòu)建SMAD7 過表達(dá)的KMS11 細(xì)胞，于體外研究SMAD7 的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，SMAD7能夠促進(jìn)KMS11細(xì)胞的活力、降低由硼替佐米介導(dǎo)的藥物敏感性以及細(xì)胞凋亡水平；繼而提示，SMAD7可促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、耐藥。

研究顯示，SMAD7 可抑制TGF-β 信號(hào)通路的激活，并在甲狀腺癌［13］、肺癌［14］、結(jié)直腸癌［15］等多種癌癥的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮功能，但其在MM中的作用機(jī)制尚不明確。BAUGHN 等［16］在原代MM 細(xì)胞及一系列細(xì)胞株中均發(fā)現(xiàn)，TGF-β 信號(hào)通路受阻。YU 等［17］報(bào)道，小鼠胚胎干細(xì)胞中的SMAD7 可通過依賴白細(xì)胞抑制因子（leukocyte inhibitory factor，LIF）的共受體糖蛋白130 激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 通路，以維持胚胎干細(xì)胞的多能性。而STAT3 的激活與腫瘤的耐藥性有關(guān)，研究［18］發(fā)現(xiàn)STAT3 通路激活抑制劑可增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞U266 對(duì)化療藥物的敏感性。同時(shí)，ZHU 等［19］構(gòu)建來那度胺耐藥細(xì)胞株XG1LenRes 后發(fā)現(xiàn)，其STAT3 通路被組成性激活，使用小分子抑制劑BP-1-102 抑制活化的STAT3 蛋白進(jìn)而可抑制該通路，使得XG1LenRes 可重新對(duì)來那度胺敏感。通過上述研究我們推測(cè)，在本研究中SMAD7 或可通過STAT3-SMAD7 途徑來發(fā)揮MM 細(xì)胞的耐藥作用。隨后，我們檢測(cè)了經(jīng)Vector或Lv-SMAD7轉(zhuǎn)染的KMS11細(xì)胞中STAT3蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示過表達(dá)SMAD7并沒有增加KMS11細(xì)胞中STAT3 的磷酸化（陰性結(jié)果未在文中展示），即STAT3 蛋白均處于低磷酸化水平，該結(jié)果與ISHIKAWA 等［20］研 究 結(jié) 果 相 一 致；繼 而 提 示，SMAD7 對(duì)KMS11 細(xì)胞增殖、耐藥的影響可能與STAT3通路無關(guān)，因此其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在MM 細(xì)胞中SMAD7呈現(xiàn)高表達(dá)，且過表達(dá)SMAD7 可促進(jìn)MM 細(xì)胞的增殖、耐藥；繼而提示，SMAD7 可能是治療MM 的有效靶點(diǎn)，且針對(duì)該相關(guān)作用機(jī)制仍需進(jìn)行更深入的探索。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院科學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)［2022］244）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Scientific Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University（Approval Letter No.［2022］244，dated 14/06/2022），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofMeasures for Ethical Review of Biomedical Research Involving Humans.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

丁賀、何楊、楊劍峰參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；丁賀、曹楊琳、魏星、楊劍峰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by DING He，HE Yang and YANG Jianfeng.The manuscript was drafted and revised by DING He，CAO Yanglin，WEI Xing and YANG Jianfeng.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-07

·Accepted：2022-06-24

·Published online：2022-07-28