劉宏強，陸艷青，高宇軒，王一云，王傳東，張曉玲

1.山西大學體育學院，太原 030006；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院骨科，上海 200092；3.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，太原 030001

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA） 以滑膜炎癥、進行性關節(jié)退變和功能喪失為特征［1-2］，是導致老年人關節(jié)疼痛、生活質量惡化的主要原因。OA 關節(jié)軟骨的不可逆變性仍然是尚未解決的問題。近年來，盡管干細胞修復軟骨的研究取得了很大進展，但OA 病理環(huán)境仍然是軟骨再生的重要障礙［3-4］。既往研究表明， 炎癥細胞因子如白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達異常是影響關節(jié)病理發(fā)展的關鍵因素［3，5-6］，可通過上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），觸發(fā)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，導致細胞外基質降解［7］。因此，特異性抑制NF-κB 通路，減輕IL-1β 和TNF-α 介導的炎癥反應，從而調節(jié)OA 炎癥微環(huán)境，是延緩OA 治療過程中關節(jié)軟骨退化和促進軟骨修復的潛在手段［8-9］。前期研究［10］表明，抑制IL-1β/NF-κB 表達可挽救間充質干細胞（軟骨干細胞）的軟骨再生功能。腫瘤壞死因子受體 相 關 因 子 6 （tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）是連接天然免疫、促炎細胞因子和抗原受體與典型的NF-κB 途徑和IL-1 信號通路的接頭/支架蛋白，其重要功能是泛素化和修飾中間信號分子［11-15］。與健康人體相比，OA 患者軟骨細胞中TRAF6 的mRNA 和蛋白表達增高［16］。然而，目前為止，TRAF6 在OA 中的作用以及抑制TRAF6 對間充質干細胞成軟骨分化能力和凋亡的影響尚不清楚。

siRNA 由21～25 個核苷酸組成，以高度序列特異性的方式降解靶mRNA，可以特異性地抑制靶基因的表達［17］。2019 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了首個siRNA 衍生療法，RNA 干擾（RNAi）介導的基因療法逐漸從研究領域向臨床應用過渡。遞送siRNA材料類型有脂質、聚合物、金屬、介孔二氧化硅和多孔硅；然而siRNA 在臨床的應用仍然受到限制，主要是因為缺乏有效的給藥系統(tǒng)［18］。在陽離子聚合物領域，聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）已得到廣泛應用［19］。商業(yè)化的PEI25kDa作為一種經(jīng)典的基因傳遞載體，因缺乏可生物降解的化學鍵（C-C 或C-N 鍵），細胞毒性大，不適合臨床使用［20-22］。本研究在無水厭氧環(huán)境中合成了帶有氨基甲酸酯鍵的小分子PEI 衍生物［23］，使鄰苯二甲醛的醛基與PEI（相對分子質量1 800）的氨基反應，形成可降解的亞胺鍵（-N=C-），命名為OPEI。本研究觀察OPEI 的細胞毒性及其在關節(jié)滑膜中的siRNA 轉染效率，探討利用OPEI 轉染TRAF6siRNA 抑制滑膜細胞中的IL-1β 信號對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成 軟 骨 分化能力的影響，以期為臨床OA 軟骨修復提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 內側半月板切除模型的建立

實驗選用8周齡SD雄性大鼠，體質量270～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號為SYXK （滬） 2017-0008。將動物隨機分為OA 組（n=20） 和假手術組（n=10）。OA 組大鼠術前用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg賽拉嗪麻醉，剃毛消毒，切斷膝關節(jié)內側副韌帶，全層切開內側半月板，切除半月板［24］。假手術組除半月板保持完好外，均接受相同的操作。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

1.2.1 細胞采集 原代滑膜細胞和BMSCs 取自相同來源的4周齡SD大鼠，體質量65～75 g。大鼠BMSCs取自脛骨和股骨后段的骨髓。細胞采集方法參考相關文獻［25-27］。細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基DMEM （HyClone，美國），加入10%熱滅活胎牛血清（Gibco，美國）和1%青霉素-鏈霉素溶液（HyClone，美國）。所有細胞均在37 ℃、含5%CO2的潮濕空氣中生長，每隔3～4 d傳代1次。第4代細胞用于后續(xù)分析。

1.2.2 IL-1β 刺激的原代滑膜細胞模型檢測 原代滑膜細胞用IL-1β （20 ng/μL）刺激48 h 后，分別轉染Lipo2000/siNC（對照組）和Lipo2000/siTRAF6（實驗組）48 h，Western blotting 檢測MMP13、TRAF6、t-p65、p-p65的表達并進行定量分析。

1.2.3 大鼠BMSCs 向軟骨分化誘導 將大鼠的BMSCs 接種于12 孔板中，每孔接種1.5×107個細胞，37 ℃培養(yǎng)2 h后，在含有地塞米松（100 nmol/L）、丙酮酸鈉（100μg/mL）、亞油酸（4.7μg/mL）、牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）、抗壞血酸2-磷酸（37.5 μg/mL）、轉化生長因子-β1（10 ng/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 OPEI及OPEI/siRNA復合物的制備

1.3.1 OPEI 的制備 反應在無水厭氧環(huán)境中進行（用高純氮氣保護）。將0.5 mmol 的鄰苯二甲醛（Aladdin，中國）溶解在10 mL 無水甲醇（Sigma-Aldrich，美國）中，滴加到0.25 mmol 的PEI 1.8K（Aladdin，中國）中，溶解在10 mL 無水甲醇中。溶液室溫攪拌24 h后，用減壓旋轉式蒸發(fā)器除去有機溶劑，殘渣溶于少量離子水中，轉入截留相對分子質量10 000 的透析袋中注射48 h，透析后溶液在-20 ℃下冷凍干燥48 h，得到最終的OPEI 產品，-40 ℃下存儲。

1.3.2 OPEI/siRNA 復合物的制備及表征觀察 將OPEI溶液以不同的質量比（m/m分別為2、3、4、5、6、7、8、9 和10），加入siRNA 溶液中以制備OPEI/siRNA 復合物，然后在室溫下孵育30 min。用90Plus粒度分析儀（Brookaven Instruments，美國）測量形成的復合物的粒徑和Zeta電位。使用原子力顯微鏡系統(tǒng)（多模納米顯微鏡Ⅲa，DI 公司，美國）觀察復合物的形態(tài)。復合物的穩(wěn)定性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，以裸siRNA為對照。

1.4 細胞毒性及細胞增殖的檢測

1.4.1 MTT 法檢測復合物的細胞毒性 將原代大鼠滑膜細胞以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，將2、5、10、15、20、30、50、75、100 μg/mL 的OPEI 載體或不同質量比值（2∶1～10∶1）的OPEI/siRNA 復合物加入孵育，每個濃度或質量比設置3 個復孔。孵育4 h 后，加入5 mg/mL PBS 溶解的MTT 溶液（20 μL/孔），37 ℃孵育4 h，棄去溶液，每孔加入150 μL 的DMSO，37 ℃搖動震蕩10 min。酶標儀（InfinitM200 PRO，TECAN，瑞士）檢測光密度［D（490 nm）］，計算細胞存活率。

1.4.2 熒光法檢測細胞增殖 將大鼠原代滑膜細胞以1×104個/孔接種于96孔微孔板中24 h，用不同質量比值的復合物，包括OPEI/siRNA（最佳質量比值為3∶1）和PEI25kDa/siRNA（最佳質量比值為2∶1）處理4、24、40 和48 h；裸siRNA 作為對照。在微孔板中加入PrestoBlue 試劑（Invitrogen，美國），37 ℃下孵育1 h，熒光法檢測細胞增殖的變化，在激發(fā)波長570 nm和發(fā)射波長610 nm處記錄熒光。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡及siRNA轉染效率

1.5.1 檢測細胞凋亡 大鼠原代滑膜細胞以1×105個/mL 的密度接種于12 孔板上，在含10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)24 h，用含有不同質量比值的復合物 的Opti-MEM （31985062，Life Technologies，美國）代替培養(yǎng)液，分別為OPEI/siRNA（最佳質量比值為3∶1）和PEI 25 kDa/siRNA（最佳質量比值為2∶1）；裸siRNA 作為對照。細胞孵育4 h，收獲后用1×PBS 洗滌。使用凋亡分析試劑盒（V13241，Life Technologies，美國）對細胞進行染色。采用FlowJo流式細胞儀分析軟件（Tree Star，美國）進行流式細胞術分析。

1.5.2 檢測siRNA 轉染效率 OPEI（質量比值為3∶1） 或PEI25kDa（質量比值為2∶1） 轉染siRNA（FITC標記）至大鼠原代滑膜細胞后，采用FlowJo流式細胞儀分析軟件（Tree Star，美國）進行流式細胞術分析，比較2組的轉染效率。

1.6 激光共聚焦及熒光顯微鏡觀察體內外滑膜細胞的siRNA轉染效率

用Cy3 熒光素標記的siRNA （GenePharma，中國）制備不同的復合物。將大鼠原代滑膜細胞以1×105個/mL 的密度種于12 孔板，培養(yǎng)24 h 后用不同復合物（OPEI/siRNA-Cy3 和PEI25kDa/siRNA-Cy3）以及裸siRNA-Cy3 轉染細胞4 h，用Hoechst 33342 和LysotrackerTMDND-99（Invitgen，美國） 分別標記細胞核和溶酶體，用激光共聚焦顯微鏡（Cell Watch，ZEISS，德國）體外觀察細胞轉染效率。在2 月齡大鼠關節(jié)腔內分別注射OPEI/siRNA-Cy3 和PEI25kDa/siRNA-Cy3，3 d 和7 d 后處死大鼠，收集滑膜，用熒光顯微鏡（Nikon，日本）觀察復合物體內轉染效率。

1.7 實時定量PCR、免疫組織化學法及Western blotting檢測

1.7.1 實時定量PCR 檢測TRAF6基因 用PBS 洗滌細胞后，用TriPure 分離劑（93956520，羅氏公司，瑞士）從細胞中提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix cDNA 合成試劑盒（RR036A-1，Takara，日本）反轉錄RNA樣品（1μg），獲得第一鏈cDNA。使用SYBR PreMix Ex TaqTM（RR420a，Takara，日本）進行實時PCR，使用LightCycler 480系統(tǒng)（羅氏公司，瑞士）測量TRAF6基因的表達。以GAPDH為內參。所用基因引物的序列如下。TRAF6-F：5′-AGAGGAATCACTTGCACG-3′；TRAF6-R： 5′-TCTGCGTTTCCATTTTTGGCG-3′。GAPDH-F： 5′-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3′；GAPDH-R：5′-CTTCCCATTTCTCAGCCG-3′。

1.7.2 免疫組織化學法檢測TRAF6 表達 于內側半月板切除后3 個月采集軟骨和滑膜標本，固定脫鈣、石蠟包埋、切片，免疫組織化學法檢測TRAF6表達。

1.7.3 Western blotting 檢測 細胞在裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 值7.4，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%Nonidet P-40，1 mmol/L PMSF，蛋白酶抑制劑） 中冰凍30 min。蛋白質組分在4 ℃下15 000×g離心10 min，經(jīng)過10%的SDS-PAGE 電泳，轉移至硝酸纖維素膜上。轉移膜用5%牛血清白蛋白封閉，加入特異性抗體，在4 ℃冰箱中孵育過夜。使用增強型化學發(fā)光試劑盒（Pierce，美國），在添加辣根過氧化物酶標記的二級抗體后對蛋白質條帶進行可視 化。 抗TRAF6（ab40675）、 MMP13（ab39012，Abcam）由Abcam 公 司（英 國） 提 供， 抗p65（8242S）、p-p65（3033S）、cleaved caspase 3（9664s）、caspase 3（9665S）和GAPDH（2118）由Cell Signaling Technology公司（美國）提供。

1.8 BMSCs 成軟骨分化的阿爾新藍染色及細胞凋亡檢測

原代大鼠滑膜細胞與IL-1β 孵育24 h 后，分別用OPEI/siNC 和OPEI/siTRAF6 處理4 h，取上清液與BMSCs 軟骨細胞分化誘導培養(yǎng)液混合，誘導分化10 d。細胞用4%多聚甲醛固定1 h，PBS 洗滌3 次，乙醇脫水，二甲苯洗滌，石蠟包埋、切片（5 μm）、載片。將切片脫蠟處理，并在室溫下用0.1%的阿爾新藍（Sigma-Aldrich，美國）原液孵育30 min。去除染料溶液，用蒸餾水輕輕清洗載玻片，用倒置顯微鏡（Eclipse TS100，尼康，日本） 觀察軟骨阿爾新藍染色結果。同時采用Western blotting 檢測IL-1β 刺激條件下，BMSCs 的cleaved caspase 3 表達水平，以及分別轉染OPEI/siNC 和OPEI/siTRAF6 后，IL-1β 刺激下BMSCs的cleaved caspase 3表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠OA 模型及原代滑膜細胞中TRAF6 的表達

術后3個月，免疫組織化學檢測結果顯示OA組關節(jié)軟骨和滑膜中TRAF6的表達明顯高于假手術組（圖1A）。Western blotting結果顯示，在IL-1β刺激下，原代滑膜細胞中TRAF6、MMP13、TRAF6、p-p65的表達水平顯著升高；與對照組（Lipo2000/siNC）相比，實驗組（Lipo2000/siTRAF6）上述蛋白的表達水平隨著TRAF6的沉默而顯著降低（圖1B～F）。

圖1 大鼠OA模型及IL-1β刺激下原代滑膜細胞中TRAF6的表達Fig 1 Expression of TRAF6 in OA models and IL-1β-stimulated primary synovial cells

2.2 OPEI/siRNA復合物的表征

瓊脂糖凝膠電泳結果證實質量比值≥2，OPEI 完全包裹siRNA（圖2A）。用動態(tài)光散射測量形成的納米顆粒的尺寸，當質量比值從2 增大至10 時，OPEI表現(xiàn)出從23 mV 到43 mV 的可變Zeta 電位（圖2B）。不同質量比值的OPEI/siRNA 復合物的粒徑見圖2C，與OPEI/siRNA 復合物形態(tài)的透射電子顯微鏡分析結果一致（圖2D～E）。

圖2 OPEI/siRNA復合物的表征Fig 2 Characterization of OPEI/siRNA polyplex

2.3 OPEI/siRNA復合物的細胞毒性

在2～50 μg/mL 濃度范圍內，與大鼠原代滑膜細胞孵育4 h 后，OPEI 聚合物的細胞存活率高于PEI25kDa（圖3A）。在質量比值為2∶1～7∶1 時，OPEI/siRNA 復合物的細胞存活率為83.54%～93.07%，而對照組PEI25kDa/siRNA 復合物的細胞存活率為42.52%～87.26%（圖3B）。細胞轉染后4、24、40、48 h 檢測細胞增殖情況，結果顯示siRNA 對照組、OPEI 組、PEI25kDa 組細胞數(shù)均呈時間依賴性增加，但PEI25kDa組細胞增殖低于OPEI組和siRNA 對照組（P＜0.05），見圖3C。大鼠原代滑膜細胞與復合物孵育4 h 后的細胞凋亡分析結果顯示，與PEI25kDa/siRNA 組（活細胞百分率為88.54%）相比，OPEI/siRNA 組（活細胞百分率93.5%）細胞凋亡減少（圖3D），復合物誘導的細胞凋亡主要發(fā)生在轉染后4 h的早期階段（圖3E～H）。

圖3 OPEI和OPEI/siRNA復合物對大鼠原代滑膜細胞的生物相容性和細胞毒性Fig 3 Biocompatibility and cytotoxicity of OPEI and OPEI/siRNA polyplexes on rat primary synoviocytes

2.4 體外和體內OPEI/siRNA 復合物的細胞轉染效率

OPEI（質量比值為3∶1）或PEI（質量比值為2∶1）轉染siRNA到大鼠原代滑膜細胞后，比較2組的轉染效率（圖4A）。在OPEI/FITC-siRNA 組的最佳質量比值為3∶1 和PEI25kDa/FITC-siRNA 組的最佳質量比值為2∶1 時，轉染效率分別為99.33%和97.17%。OPEI/siRNA （最佳質量比值為3∶1） 和PEI25kDa/siRNA（最佳質量比值為2∶1）與大鼠原代滑膜細胞孵育1 h 后，用共聚焦顯微鏡檢測細胞轉染狀況（圖4B）。溶酶體用LysotrackerTM DND-99（紅色）標記，siRNA用FAM（綠色）標記，細胞核用藍色標記。結果表明，體外OPEI/FAM-siRNA 和PEI25 kDa/FAMsiRNA 均顯示大量細胞攝取siRNA。體內研究結果顯示，OPEI/Cy3-siRNA和PEI25 kDa/Cy3-siRNA轉染的大鼠滑膜在第3 日、第7 日均顯示出高水平的siRNA轉染效率（紅色，圖4C），而陰性對照（裸siRNA）組滑膜組織中未觀察到siRNA（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖4 OPEI/siRNA復合物在體外和體內的細胞轉染效率Fig 4 Cell transfection efficiency of OPEI/siRNA polyplexs in vitro and in vivo

2.5 OPEI/siTRAF6 復合物對大鼠原代滑膜細胞TRAF6基因敲除效率

不同的質量比值的OPEI/siTRAF6 或PEI25kDa/siRNA 復合物轉染大鼠原代滑膜細胞2 d 后，熒光定量PCR結果顯示：與裸siTRAF6對照組（NC）相比，OPEI/siTRAF6 組在質量比值為3∶1、4∶1 和5∶1 時，TRAF6沉默的比例分別為58.1%、41.62%和60%；PEI25kDa/siTRAF6 組在質量比值為2∶1 時，TRAF6沉默的比例為61.38%（圖5A）。實時熒光定量PCR結果顯示，OPEI/siRNA 復合物（最佳質量比值為3∶1） 在 轉 染 細 胞 后5、7 和10 d 穩(wěn) 定 沉 默TRAF6，PEI25kDa/siRNA 復合物（最佳質量比值為2∶1）在轉染細胞后5、7 d 沉默TRAF6（圖5B）。Western blotting 檢測不同質量比值的復合物轉染細胞2 d 后TRAF6 蛋白表達，結果顯示OPEI/siTRAF6 組在質量比值為3∶1、4∶1 和5∶1 時，TRAF6基因敲除效率分別為49.05%、74.61%和83.18%（圖5C～D）。

圖5 OPEI/siTRAF6復合物轉染大鼠原代滑膜細胞的TRAF6基因敲除效率Fig 5 TRAF6 knockdown efficiency of OPEI/siTRAF6 polyplexes in rat primary synoviocytes

2.6 OPEI/siTRAF6 沉 默TRAF6 基 因 對IL-1β 誘導的大鼠原代滑膜細胞炎癥的抑制作用

將大鼠原代滑膜細胞與IL-1β 共孵育48 h，并以不同質量比值的復合物轉染4 h 后，Western blotting分析結果顯示：與裸siTRAF6 對照組相比，OPEI/siTRAF6 組（質量比值為3∶1 和4∶1）和PEI25kDa/siTRAF6組（質量比值為2∶1和2.5∶1）均可明顯抑制TRAF6表達（圖6A、B）。OPEI/siTRAF6組（質量比值為2∶1、3∶1 和4∶1）比PEI25kDa/siTRAF6 組（質量比值為2∶1、2.5∶1）能更有效地降低p-p65 的表達（圖6C、D）。

圖6 TRAF6基因敲除對IL-1β誘導的大鼠滑膜細胞炎癥的影響Fig 6 Effect of TRAF6 knockdown on IL-1β-induced inflammation in rat primary synoviocytes

2.7 TRAF6 基因敲除對BMSCs 軟骨形成能力的恢復作用

與未刺激組相比，IL-1β刺激條件下BMSCs的軟骨形成能力明顯下降；但經(jīng)OPEI/siTRAF6 處理后，與OPEI/siNC 對照相比，阿爾新蘭染色顯示BMSCs的軟骨形成能力明顯恢復（圖7A）。Western blotting結果顯示：與對照組（Naked siNC）相比，IL-1β 刺激條件下，BMSCs 的cleaved caspase 3 表達明顯升高（圖7B）。定量分析結果顯示，IL-1β+OPEI/siTRAF6組cleaved caspase 3 的表達低于IL-1β+OPEI/siNC 組（圖7C）。caspase 3 在各組中的表達水平無明顯差異（圖7D）。該結果提示TRAF6基因敲除可挽救IL-1β誘導的炎癥條件下BMSCs 的成軟骨分化及抑制BMSCs凋亡。

3 討論

OA 的發(fā)病機制極其復雜。與趨化因子和促炎細胞因子表達相關的炎癥是關節(jié)炎發(fā)病的原因之一。在多種致炎細胞因子中，TNF-α、IL-6 和IL-1β 在關節(jié)炎發(fā)病機制中起重要作用。IL-1、IL-6、IL-17 和TNF-α的異常水平刺激NF-κB激活，從而導致關節(jié)炎癥和軟骨破壞［28-30］。研究表明，泛素連接酶TRAF6在天然免疫、促炎細胞因子和抗原受體與典型的NF-κB 途徑之間起著關鍵的調節(jié)作用［31］。本研究通過免疫組織化學方法檢測到TRAF6在大鼠OA模型滑膜和軟骨中均有過表達，提示TRAF6可能在OA的病理過程中起重要作用。進一步用siRNA 敲除TRAF6，發(fā)現(xiàn)可明顯降低IL-1β 誘導的大鼠原代滑膜細胞炎癥模型中MMP13 和p-p65 的表達，提示抑制TRAF6 活性是治療OA的一種很有前景的新策略。

臨床siRNA的治療面臨的主要挑戰(zhàn)之一是缺乏有效和安全的優(yōu)化遞送載體［32-33］。商業(yè)上可獲得的PEI25kDa 是一種經(jīng)典的基因遞送載體，但缺乏可生物降解的化學鍵（C-C 或C-N 鍵），且毒性太高，不適合臨床使用。為了優(yōu)化siRNA向關節(jié)的轉移，我們合成了一種小分子交聯(lián)聚乙烯亞胺（OPEI）。利用鄰苯二甲醛的醛基與PEI1.8K 的氨基反應生成可降解的亞胺鍵（-N=C-）。結果表明，OPEI/siRNA 在大鼠原代滑膜細胞中具有與PEI25kDa/siRNA 相似的轉染效率，但細胞毒性明顯低于PEI25kDa/siRNA，OPEI 組的細胞凋亡率低于PEI25kDa 組。細胞存活率的提高可能是OPEI/siRNA組與PEI25kDa/siRNA組相比可更穩(wěn)定地抑制TRAF6 的原因［34］。體內觀察結果顯示OPEI/Cy3-siRNA 轉染后3、7 d，滑膜細胞Cy3-siRNA 高表達。這些結果表明，OPEI 可作為一種高效、低毒siRNA體內外輸送載體。

炎癥因子的級聯(lián)作用可導致關節(jié)軟骨的破壞，因此，抑制炎癥因子的表達已成為治療OA的重要策略。然而，目前的研究表明，生物制劑可以延緩惡化的進程，但不能促進組織修復［4］。與迄今大多數(shù)直接抑制IL-1β 和TNF-α 的研究不同［8-9，35］，我們的研究表明，通過siRNA靶向IL-1β的下游可能會產生更好的結果。大多數(shù)關節(jié)炎病例與創(chuàng)傷無關，有多種潛在的主要原因，包括遺傳傾向、衰老、生物力學改變、肥胖或全身炎癥狀況［36］。目前關節(jié)炎的發(fā)病機制尚不清楚，但慢性細胞因子暴露、信號異常和體細胞突變等可能參與了病理過程［37］。本研究中，將TRAF6siRNA 轉染大鼠原代滑膜細胞來抑制TRAF6 表達，一方面抑制IL-1/MMP13/p65 信號轉導，另一方面減少BMSCs 凋亡，并顯著激發(fā)由IL-1β誘導的炎癥抑制的BMSCs的軟骨形成能力。與現(xiàn)有的治療方法相比，這代表著生理和功能上的結果都有所改善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TRAF6在大鼠OA模型滑膜和軟骨中過表達。我們進一步合成了一種低毒、可生物降解的小分子PEI（OPEI），將siTRAF6 轉染到TRAF6基因上。結果顯示，抑制TRAF6 不僅可以對抗IL-1/MMP13/p65 信號轉導途徑，還可以減少BMSCs的凋亡，并顯著增強IL-1β誘導的炎癥抑制的BMSCs 的軟骨形成能力，提示TRAF6 可能是OA 治療的新靶點。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫(yī)學院倫理委員會的審核批準（審批號：XHEC-F-NSFC-2018-275）。所有實驗過程均遵照上海交通大學動物保護委員會批準的程序和原則進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No.XHEC-F-NSFC-2018-275，dated 01/03/2018），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines and principles approved by the Animal Protection Committee of Shanghai Jiao Tong University.

作者貢獻/Authors'Contributions

劉宏強、張曉玲參與了實驗設計；劉宏強、陸艷青、高宇軒參與了論文的寫作和修改；王一云、王傳東參與了數(shù)據(jù)分析。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Hongqiang and ZHANG Xiaoling.The manuscript was drafted and revised by LIU Hongqiang， LU Yanqing and GAO Yuxuan. The data was analyzed by WANG Yiyun and WANG Chuandong. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-06

·Accepted：2022-06-18

·Published online：2022-07-28