柴 焱， 張 濤， 范引科 ，惠愛武， 趙林濤， 李 芳， 張小麗

1 寶雞市中醫(yī)醫(yī)院 臨床藥學室， 陜西 寶雞 721000； 2 清華德人西安幸福制藥有限公司，西安 710043； 3 陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所， 西安 710003

肝纖維化是指各種致病物質(zhì)反復長期刺激肝細胞，致使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積于肝細胞的一種慢性損傷反應，是導致肝硬化、肝癌等嚴重肝臟疾病的重要因素[1]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1對肝纖維化形成產(chǎn)生至關重要的影響，被認為是肝星狀細胞(HSC)激活過程中極其重要的物質(zhì)。Smad蛋白是TGF將通路信號傳至細胞核內(nèi)的重要下游信號因子，TGFβ1通過激活下游信號調(diào)控因子Smad2和Smad3對其促肝纖維化產(chǎn)生影響。研究[2]表明肝纖維化小鼠正向調(diào)控因子Smad2和Smad3表達明顯升高。Smad7則作為TGFβ1/Smad信號通路的負向調(diào)控因子，主要通過與Smad3競爭，抑制甚至中斷TGFβ1信號傳遞，從而抑制肝纖維化發(fā)生和發(fā)展，若清除Smad7基因可導致小鼠肝纖維化的發(fā)生[3]，由此可見TGFβ1/Smad信號通路的傳遞調(diào)節(jié)及相關基因表達在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

在中醫(yī)理論中并無“肝纖維化”這一病名辨證，常將其歸于“癥瘕積聚”的辨證范疇。陜西省中醫(yī)醫(yī)院成冬生主任醫(yī)師根據(jù)30多年的臨床經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)慢性病毒性肝炎導致的肝纖維化患者多屬于淤血阻絡，肝血虛損證型，從養(yǎng)血柔肝、軟堅通絡的辨證思路出發(fā)，研制出了由多味中藥組成的方劑——養(yǎng)血柔肝丸。養(yǎng)血柔肝丸在預防肝纖維化發(fā)生、抑制肝纖維化進展方面療效顯著，深受患者推崇。本研究重在觀察養(yǎng)血柔肝丸對多因素誘導的肝纖維化大鼠TGFβ1/Smad信號通路的調(diào)節(jié)作用，深入探索養(yǎng)血柔肝丸治療肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只(體質(zhì)量為180～220 g)，提供單位：斯貝福(北京)生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK(陜)2012-006。大鼠標準飼料喂養(yǎng)，飲用水自由，均分籠飼養(yǎng)，每籠5只，光照與黑暗各12 h交替處理，濕度為50%～60%，溫度為20～22 ℃，適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實驗藥物和試劑 養(yǎng)血柔肝丸，提供單位：陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，批號：20210403。每克藥丸相當于生藥2.376 g。組方：當歸、熟地黃、酸棗仁、五味子、雞血藤、雞內(nèi)金、阿膠、鱉甲等13味藥組成。功能主治：養(yǎng)血柔肝，軟堅通絡。主要用于慢性病毒性肝炎肝纖維化中醫(yī)辨證屬肝血虛損，瘀血阻絡證，癥見身困乏力，口干不欲飲，頭暈目眩，四肢麻木，齒鼻衄血，納食減少或尚可，二便調(diào)，失眠多夢，舌質(zhì)暗紅苔薄白或薄黃或少苔，脈細弦或脈細弦澀。用法用量：口服，1日2次，1次3～5 g。扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責任公司，批號：z20020073)；四氯化碳(天津市天力化學試劑有限公司，批號:191008);豬血清(河南巨石生物科技有限公司，生產(chǎn)日期：20210725)；食用酒精(紅星二鍋頭56°)(北京紅星股份有限公司)。TGFβ1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體均由美國Abcam公司提供；總RNA提取試劑盒(CW0580 03877/05421)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(CW2569 01133/50287)、定量PCR試劑盒(CW0957 01170/20210)均由康為世紀生物科技股份有限公司提供；RIPA裂解液(P0013E 111219200624)由碧云天生物技術公司提供。

1.1.3 主要設備與儀器 3-18R高速低溫離心機(江蘇恒諾儀器制造公司)；LineGene9600定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)；Nano Drop2000超微量分光光度計(美國賽默飛公司)；DYCZ-25E型P4垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；5200multi成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組與給藥 雄性大鼠50只隨機分成空白對照組(n=6)、多因素模型組(n=9)、養(yǎng)血柔肝丸高劑量組(n=9)、養(yǎng)血柔肝丸中劑量組(n=9)、養(yǎng)血柔肝丸低劑量組(n=9)和扶正化瘀膠囊組(n=8)，共6組。空白對照組給予正常飲水和正常飼料，剩余各組大鼠給予改良高脂低蛋白飼料，并且第1周每日灌胃10%食用酒精，以后每日灌胃5%食用酒精。除空白對照組外，各組大鼠皮下注射含40%四氯化碳的橄欖油溶液，首次注射5 mL/kg，以后3 mL/kg，2次/周，空白對照組給予等體積橄欖油2次/周。除空白對照組外，各組大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL/只，2次/周，空白對照組給予等體積生理鹽水2次/周，連續(xù)12周。從第7周開始，給予養(yǎng)血柔肝丸，分為高劑量組(9.5 g/kg)、中劑量組(4.75 g/kg)、低劑量組(2.38 g/kg)，扶正化瘀膠囊組(0.75 g/kg)，空白對照組、多因素模型組每日灌胃等量蒸餾水，連續(xù)灌胃6周，最后一次給藥后，禁食時間8 h，但不限制飲水，麻醉處理大鼠。因大鼠自身對四氯化碳不耐受等原因存在死亡情況，12周后每組大鼠各6只。

1.2.2 肝臟病理學 從各組大鼠肝臟中切取部分肝組織，置于含有4%多聚甲醛溶液中固定，固定時間24 h，再經(jīng)肝組織脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(片厚5 μm，每個肝臟組織制作2張切片)后，一組切片用于HE染色，另一組進行Masson染色。最后經(jīng)中性樹膠封片。

1.2.3 定量PCR檢測大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA的表達 采用Prime5.0軟件設計β-actin、TGFβ1、Smad3、Smad7基因引物序列(表1)，由西安依科生物有限公司合成。提取肝組織中RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按定量PCR試劑盒要求檢測TGFβ1、Smad3、Smad7基因的mRNA表達水平。反應參數(shù):95 ℃ 15 s(變性)、60 ℃ 40 s(退火)，循環(huán)40次，檢測基因的表達量使用2-△△ct法計算。

1.2.4 Western blot檢測大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表達 使用RIPA裂解液進行肝組織蛋白提取，RIPA提前加入蛋白酶抑制劑，冰上勻漿后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清作為蛋白樣品。按BCA試劑盒要求測定肝組織中各蛋白濃度，蛋白加熱變性后，用垂直電泳儀分離并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，并使用濃度為5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST搖洗膜3次，加入提前配置好的第一抗體，在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，次日，在室溫條件下孵育1 h復溫，TBST反復洗膜3次，再加入提前配置好的第二抗體，在37 ℃環(huán)境下孵育1 h，TBST反復洗膜3次，使用成像儀進行化學發(fā)光成像操作，使用圖像分析軟件image J對曝光結果進行數(shù)據(jù)處理。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色和Masson染色觀察大鼠肝組織病理學變化 HE染色和Masson染色顯示空白對照組肝組織中未顯示任何纖維化組織增生,肝小葉結構完整、清晰可見，肝組織細胞排列整齊，未顯示細胞壞死;多因素模型組可見大量脂肪變性，肝小葉結構破壞嚴重，肝細胞排列錯亂，竇周隙清晰可見膠原纖維延伸，匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍纖維化明顯，有假小葉形成。與多因素模型組相比，扶正化瘀膠囊組和養(yǎng)血柔肝丸各劑量組的纖維組織增生均有不同程度的降低。養(yǎng)血柔肝丸高劑量組和扶正化瘀膠囊組均可見少量脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，小葉間有細小纖維束形成，未形成假小葉的結構。養(yǎng)血柔肝丸中劑量組部分可見脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，未形成假小葉的結構。養(yǎng)血柔肝丸低劑量組可見脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，匯管區(qū)普遍的纖維束，已經(jīng)形成纖維間隔和假小葉的結構(圖1、2)。

2.2 各組大鼠肝組織中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表達 與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織TGFβ1、Smad3 mRNA的表達明顯升高(P值均<0.05)，而Smad7 mRNA的表達顯著降低(P<0.05);養(yǎng)血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組TGFβ1、Smad3 mRNA的表達與多因素模型組相比均有不同程度的降低(P值均<0.05)，表現(xiàn)出的下調(diào)作用與劑量呈正相關，以養(yǎng)血柔肝丸高劑量組效果最為明顯。養(yǎng)血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組Smad7 mRNA的表達與多因素模型組相比均有不同程度的升高(P值均<0.05)，表現(xiàn)出的上調(diào)作用與劑量呈正相關，以養(yǎng)血柔肝丸高劑量組作用最為顯著(圖3)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

注:a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養(yǎng)血柔肝丸低劑量組;e，養(yǎng)血柔肝丸中劑量組;f，養(yǎng)血柔肝丸高劑量組；箭頭指示病變。圖1 各組大鼠肝組織細胞HE染色(×100)Figure 1 HE staining of liver tissues of rats in each group(×100)

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養(yǎng)血柔肝丸低劑量組;e，養(yǎng)血柔肝丸中劑量組;f，養(yǎng)血柔肝丸高劑量組；箭頭指示病變。

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養(yǎng)血柔肝丸低劑量組;e，養(yǎng)血柔肝丸中劑量組;f，養(yǎng)血柔肝丸高劑量組。

2.3 各組大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表達 與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織中TGFβ1蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；與多因素模型組比較，養(yǎng)血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中TGFβ1蛋白的表達量減少(P<0.05)。與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織中Smad3蛋白的表達明顯增加而Smad7蛋白的表達明顯減少(P值均<0.05);養(yǎng)血柔肝丸高、中劑量組與扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中Smad3蛋白的表達較多因素模型組降低(P值均<0.05)；養(yǎng)血柔肝丸各劑量組與扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中Smad7蛋白的表達較多因素模型組顯著升高(P值均<0.05)，以養(yǎng)血柔肝丸高劑量組作用最為明顯(圖4、5)。

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養(yǎng)血柔肝丸低劑量組;e，養(yǎng)血柔肝丸中劑量組;f，養(yǎng)血柔肝丸高劑量組。圖4 Western blot檢測各組大鼠肝組織TGFβ1、Smad3、Smad7表達結果Figure 4 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 in liver tissues detected by Western blot

3 討論

當肝細胞受到藥物、酒精、病毒等長期刺激時，肝細胞會發(fā)生自我修復反應，進而發(fā)生纖維化，肝纖維化是發(fā)展為慢性肝病甚至肝硬化的必經(jīng)階段，但是在此階段尚有逆轉(zhuǎn)的可能，若進入肝硬化階段則難以逆轉(zhuǎn)[4]。肝纖維化的發(fā)生是多種細胞因子通過多條信號通路共同作用的復雜病理發(fā)展過程，其中HSC的活化被認為是肝纖維化發(fā)生的重要一環(huán)[5]，肝臟受到損傷或受到炎癥細胞因子的作用，誘導產(chǎn)生ECM，最終導致肝纖維化[6]。

HSC從活化、增殖再到轉(zhuǎn)化為成纖維母細胞，期間產(chǎn)生大量ECM，是發(fā)生纖維化的核心機制。目前研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，TGFβ1是導致肝纖維化最為關鍵的細胞因子之一。TGFβ1通過激活Smad通路參與肝干細胞促進肝纖維化的過程[9]。在肝纖維化TGFβ1/Smad通路相關研究中，研究較清楚明確的有TGFβ1/Smad2、TGFβ1/Smad3、TGFβ1/Smad4、TGFβ1/Smad7。Smad4基因和Smad7基因反向作用調(diào)節(jié)TGFβ1信號傳導，通過與Smad2基因和Smad3基因競爭性的結合TGFβRⅠ，導致TGFβ1信號傳導被阻斷，抑制肝纖維化的發(fā)展。相關研究[10]顯示，Smad3基因是導致小鼠肝纖維化的相關因子，若將該基因移除，可使膠原蛋白表達量顯著下降，Smad7基因負向調(diào)節(jié)表達量則呈顯著增長。若將Smad7基因移除，大鼠的HSC數(shù)目增多，ECM大量蓄積。Smad7蛋白表達量的增加可以抑制HSC增殖及Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，抑制肝纖維化的蔓延[11]。本次實驗結果顯示，養(yǎng)血柔肝丸能顯著降低肝纖維化大鼠肝TGFβ1及Smad3基因的表達，上調(diào)Smad7基因的表達，證明TGFβ1/Smad信號通路是養(yǎng)血柔肝丸治療肝纖維化的作用機制之一。

綜上所述，養(yǎng)血柔肝丸具有顯著的抗肝纖維化療效，其機制可能是養(yǎng)血柔肝丸抑制TGFβ1、Smad3基因的表達，上調(diào)Smad7基因的表達，抑制TGFβ1/Smad信號通路激活，減少HSC的產(chǎn)生。這為治療肝纖維化提供了實驗基礎，為臨床進一步使用養(yǎng)血柔肝丸改善肝纖維化、保護肝臟功能提供了更多理論依據(jù)。

倫理學聲明：本研究方案于2020年6月19日經(jīng)由陜西省中醫(yī)藥研究院倫理委員會審批，批號：(2020)倫審意見第(512)號，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

注:a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養(yǎng)血柔肝丸低劑量組;e，養(yǎng)血柔肝丸中劑量組;f，養(yǎng)血柔肝丸高劑量組。圖5 各組大鼠肝組織細胞TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白表達水平Figure 5 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 proteins in liver tissues of the rats in each group

作者貢獻聲明：柴焱負責數(shù)據(jù)整理，撰寫論文；張濤、范引科、惠愛武、趙林濤、李芳負責實驗操作，數(shù)據(jù)分析，病理分析，并指導修改文章；張小麗負責課題設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。