李曉慧，趙衛(wèi)星，康利允，梁慎，常高正，李海倫，王慧穎，徐小利，高寧寧

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南 鄭州 450002)

西瓜(Citrullus lanatus)屬于葫蘆科，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。小果型西瓜由于熟性早、品質(zhì)佳，越來(lái)越受消費(fèi)者青睞，種植面積也逐年擴(kuò)大[1]。小果型西瓜在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受溫度和光照的影響較大，早春的低溫弱光會(huì)抑制西瓜生長(zhǎng)，使其發(fā)育不良，造成西瓜減產(chǎn)、品質(zhì)下降[2]。目前，最經(jīng)濟(jì)有效的方法是選育耐低溫弱光品種，但小果型西瓜的種質(zhì)資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，對(duì)小果型西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，有利于種質(zhì)資源的更好利用和創(chuàng)新。

SSR分子標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，一般是由重復(fù)的幾個(gè)核苷酸為單位組成的串聯(lián)序列。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜的研究主要在指紋圖譜構(gòu)建[3－5]、品種純度鑒定[6－8]以及遺傳多樣性[9－12]等方面。前人對(duì)西瓜耐低溫弱光種質(zhì)的研究多集中在生理生化[13－15]和分子機(jī)理方面[16－18]，未見(jiàn)有關(guān)于西瓜耐低溫弱光種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。因此，本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)耐低溫弱光和不耐低溫弱光共32份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以期為耐低溫弱光西瓜種質(zhì)資源的合理利用和遺傳育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試32份小果型西瓜材料為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所經(jīng)過(guò)多年收集及創(chuàng)新的品種(系)。其中，1~10號(hào)為耐低溫弱光型，11~32號(hào)為不耐低溫弱光型(表1)。

表1 供試32份小果型西瓜品種

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 試驗(yàn)于2021年4月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所溫室取樣，在西瓜長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，取100 mg幼嫩真葉，在破碎儀中進(jìn)行破碎，利用改良的CTAB法[19]提取DNA，將提取的原液稀釋至30 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR擴(kuò)增及檢測(cè) SSR反應(yīng)采用15μL體系:2×MasterMix 7.5μL(購(gòu)自BioTeke公司)，DNA模板(30 ng/μL)1μL，正、反向引物(0.4 μmol/L)各0.4μL，ddH2O 5.7μL，反應(yīng)程序參考黃春瓊等[20]。選取耐低溫弱光和不耐低溫弱光的西瓜品種各1份對(duì)50對(duì)SSR引物組合進(jìn)行篩選(表2)，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，具體參考梁寶萍等[21]的方法，篩選擴(kuò)增位點(diǎn)穩(wěn)定清晰且多態(tài)性高的引物用于分析供試小果型西瓜材料。

表2 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計(jì)原始數(shù)據(jù)矩陣，人工讀帶將圖譜上出現(xiàn)條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”。使用NTSYS－pc 2.1e軟件中的UPGMA方法獲取遺傳相似系數(shù)，利用Treeplot模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；用PopGen Version 3.2軟件計(jì)算不同類型小果型西瓜的遺傳多樣性指數(shù)，包括觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、遺傳一致度和遺傳距離等，并用Cophenetic相關(guān)性方法對(duì)相似系數(shù)矩陣和聚類分析結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增多態(tài)性

從50對(duì)SSR引物中篩選出21對(duì)穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性高的引物，對(duì)32份小果型西瓜進(jìn)行擴(kuò)增，共得到201個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)9.6個(gè)，多態(tài)性比率為74%(表3)，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度在80~500 bp之間。其中，Pr25多態(tài)性位點(diǎn)最多，為26個(gè)(圖1)，Pr8和Pr18擴(kuò)增多態(tài)性比率可達(dá)90%以上，Pr30多態(tài)性比率最低，為38%。

圖1 引物對(duì)Pr25對(duì)32份西瓜的SSR擴(kuò)增圖

表3 SSR擴(kuò)增多態(tài)性

2.2 不同類型西瓜種質(zhì)間的遺傳多樣性

遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果(表4)顯示，耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)分別為1.6333、1.7111，總體值為1.7556；有效等位基因數(shù)(Ne)分別為1.3395、1.3658，總體值為1.3929；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)分別為0.2046、0.2186，總體值為0.2366；Shannon’s信息指數(shù)(I)分別為0.3117、0.3337，總體值為0.3614。由以上數(shù)據(jù)可知，供試32份小果型西瓜種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性，不耐低溫弱光小果型西瓜遺傳多樣性指數(shù)均高于耐低溫弱光型，表明不耐低溫弱光型西瓜遺傳多樣性比耐低溫弱光型豐富。耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的遺傳一致度為0.9340，遺傳距離為0.0682(表5)，表明兩種供試小果型西瓜親緣關(guān)系較近。

表4 不同類型西瓜品種(系)遺傳多樣性指數(shù)

表5 不同類型西瓜品種(系)遺傳一致度和遺傳距離

2.3 不同類型西瓜種質(zhì)間的聚類分析

供試西瓜的遺傳相似系數(shù)在0.60~0.92之間(表6)。耐低溫弱光小果型西瓜‘S5’和不耐低溫弱光小果型西瓜‘金冠’、耐低溫弱光小果型西瓜‘MW020’和不耐低溫弱光小果型西瓜‘A20－6’兩組的遺傳相似系數(shù)最小，為0.60，說(shuō)明兩組之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。不耐低溫弱光小果型西瓜‘S7’和‘S8’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.92，說(shuō)明兩者之間的親緣關(guān)系最近。

表6 32份西瓜種質(zhì)遺傳相似系數(shù)

利用NTSYS－pc 2.1e軟件對(duì)21對(duì)SSR引物獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以遺傳系數(shù)0.73為界，通過(guò)UPGMA聚類，可將32份供試小果型西瓜材料分為4大類(圖2)，耐低溫弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大類，不耐低溫弱光小果型西瓜在4大類中均有分布。第Ⅰ大類8個(gè)品種，包括6份耐低溫弱光型和2份不耐低溫弱光型；第Ⅱ大類5個(gè)品種，包括4份耐低溫弱光型和1份不耐低溫弱光型；第Ⅲ大類僅包含1個(gè)不耐低溫弱光品種；第Ⅳ大類18個(gè)品種，均為不耐低溫弱光品種。

圖2 32份西瓜種質(zhì)聚類分析

Cophentic相關(guān)性可以反應(yīng)遺傳相似系數(shù)矩陣和UPGMA聚類結(jié)果矩陣間的關(guān)聯(lián)程度。通過(guò)Cophentic檢驗(yàn)得出兩個(gè)矩陣的相關(guān)系數(shù)(r值)為0.75，說(shuō)明遺傳相似性原始數(shù)據(jù)與UPGMA聚類結(jié)果之間有密切的關(guān)聯(lián)性，聚類結(jié)果準(zhǔn)確。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)選取50對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)32份小果型西瓜供試材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，共得到201個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)9.6個(gè)，多態(tài)性比率可達(dá)74%，選取引物的擴(kuò)增多態(tài)性較高，說(shuō)明篩選出的21對(duì)SSR引物可用于分析西瓜種質(zhì)的遺傳背景。本研究結(jié)果高于張法惺等[22]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)96份西瓜品種的遺傳多樣性(11.7%)，而低于Solmaz等[23]對(duì)土耳其不同區(qū)域的西瓜品種進(jìn)行SSR標(biāo)記的遺傳多態(tài)率(100%)，這可能與西瓜材料來(lái)源的地域豐富程度有關(guān)。

本研究表明，32份供試西瓜種質(zhì)資源的Na、Ne、H和I分別為1.7556、1.3929、0.2366、0.3614，遺傳變異參數(shù)低于Mashilo等[24]對(duì)34份野生西瓜地方品種的SSR標(biāo)記以及石磊等[25]對(duì)50份籽用西瓜種質(zhì)資源的SSR分析結(jié)果，說(shuō)明供試西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富度不高，這可能與樣本量少有關(guān)。不耐低溫弱光種質(zhì)資源(Na＝1.7111，Ne＝1.3658，H＝0.2186，I＝0.3337)比耐低溫弱光種質(zhì)資源(Na＝1.6333，Ne＝1.3395，H＝0.2046，I＝0.3117)遺傳多樣性豐富。耐低溫弱光和不耐低溫弱光兩種類型供試小果型西瓜的遺傳一致度為0.9340，遺傳距離為0.0682，表明兩種供試小果型西瓜親緣關(guān)系較近。

通過(guò)UPGMA聚類比較將32份供試西瓜材料分為4大類。耐低溫弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大類，不耐低溫弱光小果型西瓜在4大類中均有分布。表明不耐低溫弱光型的遺傳多樣性較耐低溫弱光型豐富，這與前面遺傳多樣性參數(shù)結(jié)果一致。Cophentic相關(guān)性檢驗(yàn)的遺傳相似系數(shù)矩陣和UPGMA聚類結(jié)果矩陣間的相關(guān)系數(shù)為0.75，說(shuō)明兩者之間有密切的關(guān)聯(lián)性，聚類結(jié)果準(zhǔn)確。SSR分子標(biāo)記結(jié)果表明，供試小果型西瓜間的親緣關(guān)系較近，因此還需擴(kuò)寬種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，引進(jìn)新種質(zhì)。本研究為揭示小果型西瓜種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系和新品種選育提供了理論參考。