陳奇劍 李春燕 肖 先 劉曉龍 薛金濤▲

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南新鄉(xiāng) 453002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院生物與基礎醫(yī)學實驗教學中心，河南新鄉(xiāng) 453003

作為一個重大公共衛(wèi)生問題，抑郁癥具有高自殺率、高自殘率和高復發(fā)率的特點。經(jīng)典的抗抑郁藥物起效慢、療效較差，因此尋找快速、有效和安全的藥物用于抑郁癥的治療為當前研究的熱點[1-6]。翅果菊（pterocypsela elata）為菊科植物翅果菊Pterocypsela elata（Hemsl.）Shih的根或全草。本研究從翅果菊中共分離得到18個活性成分，其中萵苣苷B（lactuside B，LB）是一種新型化合物，前期藥理學研究表明LB和翅果菊具有良好的抗抑郁、改善記憶、抗腦缺血和抗心肌缺血作用[7-10]。鑒于此，翅果菊和LB在抑郁癥的治療中具有廣闊的應用前景，但其作用機制尚不清楚，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法研究翅果菊發(fā)揮抗抑郁作用的主要活性成分和作用機制。

1 資料與方法

1.1 軟件

ChemBioOffice軟件（ChemBioDraw和ChemBio3D，Ultra 14.0），Open Babel GUI軟件（Version 2.4.1），Autodock Vina軟件（Version 1.1.2），PyMoL軟件（Version 1.7.2.1）和Autodock Tools軟件（Version 1.5.6）。

1.2 數(shù)據(jù)庫

DrugBank數(shù) 據(jù) 庫（Version 5.1.3，https://www.drugbank.ca/），Batman數(shù) 據(jù) 庫 （http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index），String數(shù)據(jù)庫 （Version 11.0，http://www.string-db.org/）和The Protein Data Bank（PDB）數(shù) 據(jù) 庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）。

1.3 網(wǎng)絡藥理學

整理課題組從翅果菊中分離得到的化學分子[7-10]，在ChemBioOffice軟件中分別畫出各化合物化學結(jié)構(gòu)式，以CDX格式保存。利用Open Babel GUI軟件將CDX格式文件轉(zhuǎn)換為Inchi格式，并上傳至Batman數(shù)據(jù)庫獲得各成分的作用靶點，選擇與化學成分擬合度高（得分值Z’-score ≥ 23）的靶點進行下一步的分析。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中以“Depression”（抑郁癥）為關(guān)鍵詞進行檢索，篩選出作用于抑郁癥的活性靶點。將Batman數(shù)據(jù)庫中獲得的化學成分作用靶點與DrugBank數(shù)據(jù)庫中的抗抑郁癥的活性靶點進行交叉對比，篩選翅果菊抗抑郁癥的活性成分和作用靶點。在String數(shù)據(jù)庫，將物種限定為“Homo sapiens”，對篩選得到的靶點進行基因功能注釋（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，以對翅果菊的功能分布和通路注釋進行研究分析。

1.4 分子對接

采用ChemBioOffice軟件的ChemBio3D功能將LB和guaianolide Ⅰ（Ⅰ）化學結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成三維格式，并在PDB數(shù)據(jù)庫檢索并下載目的作用靶點的三維蛋白結(jié)構(gòu)，利用Autodock Tools軟件對蛋白質(zhì)進行常規(guī)處理（加氫、去水、加電荷等），并將蛋白和藥物活性成分轉(zhuǎn)化為pdqpt格式文件保存。采用Autodock Tools軟件進行分子對接參數(shù)的設置，并進一步使用Autodock Vina軟件進行分子對接。最后使用PyMoL軟件處理對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 活性成分整理

本研究前期研究中從翅果菊中提取分離得到18個 化 學 成 分[7-10]，分 別 是LB，11β，13-二氫萵苣內(nèi)酯乙酸酯，11β,13-二氫萵苣內(nèi)酯，GI，guaianolide Ⅱ，guaianolide Ⅲ，（24R）-5α-豆甾-7，22（E）-二烯-3α-醇，齊墩果酸，β-香樹脂），β-谷甾醇，胡蘿卜苷，3，3′，4-三甲氧基鞣花酸，硬脂酸，3-oxo-friedlane，stigmasterol，aralia cerebroside，ursa-12-ene-11-one-3-oloctocosate和hexacosanoic acid，其中LB從翅果菊中分離得到一種新型化合物。

2.2 抗抑郁活性成分和作用靶點的篩選

通過統(tǒng)計分析Batman數(shù)據(jù)庫篩選得到的活性靶點，翅果菊18個活性成分共得到409個作用靶點。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中共檢索得到292個抗抑郁作用靶點。交叉對比化學成分的作用靶點與抗抑郁作用靶點，篩選得到1作用靶點γ-氨基丁酸受體亞單位β-3（γ-aminobutyric acid receptor subunit beta-3，GABRB3，ID：P28472），翅果菊中共有2個藥效活性成分（LB和GI）作用于該靶點。

2.3 GO富集分析和KEGG通路分析

在上述對翅果菊活性成分和作用靶點篩選的基礎上，采用GO富集分析和KEGG代謝通路分析進一步進行網(wǎng)絡藥理學研究。GO富集分析主要包括生物過程、分子功能和細胞組分3個部分，并以P.Adust分析某一指標和功能對富集的重要性，P.Adust值<0.05表示相應指標具有顯著性影響，P.Adust值越小，表示越具有顯著性影響，統(tǒng)計分析中一般取其對數(shù)的負值：-log10（P. Adust），故其值越大，表示越具有顯著性。

圖1A，GO富集分析共發(fā)現(xiàn)有顯著性影響的生物過程17個，其中顯著性意義較大的有γ-氨基丁酸信號通路（P.Adust=8.11E-26）、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運（P.Adust=8.05E-21）和G蛋白耦聯(lián)受體信號通路（P.Adust=1.05E-12）等。圖1B，共發(fā)現(xiàn)有顯著性影響的分子功能7個，其中顯著性意義較大的有GABA-A受體活性（P.Adust = 4.55E-27）、細胞外配體門控離子通道活性（P.Adust=2.67E-22）和氯離子通道活性（P.Adust=3.64E-22）等。圖1C，共發(fā)現(xiàn)有顯著性影響的細胞組分5個，其中顯著性意義較大的有氯離子通道復合體（P.Adust=1.08E-23）、GABA-A受 體復 合物（P.Adust =1.08E-23）和 突觸后膜（P.Adust=1.69E-17）等。圖2，KEGG通路分析結(jié)果表明，翅果菊活性成分作用于抑郁癥的KEGG通路中有顯著性影響的共有7個，其中顯著性意義較大的有尼古丁成癮（P.Adust=3.47E-25）、GABA能 突 觸（P.Adust=2.36E-22）和 嗎 啡 成 癮（P.Adust=2.36E-22）等。

圖1 作用靶點GO富集分析結(jié)果

圖2 作用靶點的KEGG通路分析結(jié)果

2.4 分子對接

分子對接方法廣泛應用于藥物活性分子與靶蛋白的對接分析[11-16]。表1在PDB數(shù)據(jù)庫以GA B R B 3為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)蛋白受體，共得到11個蛋白受體，將LB、GI分別與11個蛋白受體文件進行分子對接。一般認為分子與蛋白的結(jié)合自由能（Affinity）越小，兩者結(jié)合越緊密牢固，結(jié)合能<-5.0 kcal/mol時有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能<-7.0 kcal/mol時提示有強烈的結(jié)合活性[11-12]。表1 LB與除7A5V外的其余10個蛋白受體均具有強烈的結(jié)合活性（Affinity<-7.0 kcal/mol），其 中 與6I53的 結(jié) 合活性最強（Affinity=-9.2 kcal/mol），其分子對接結(jié)果如圖3A，LB與6I53的結(jié)合位點在其蛋白內(nèi)部的空腔中（圖中數(shù)字為LB與6I53中相近的氨基酸位點的分子間距離，單位：?）。G I與11個蛋白受體均具有強烈的結(jié)合活性（Affinity<-7.0 kcal/mol），其 中 與6I53和6HUG的結(jié)合活性最強，結(jié)合自由能均為9.5 kcal/mol，其對接結(jié)果見圖3B和圖3C，GI與6I53和6HUG的結(jié)合位點均在其蛋白外側(cè)的空腔中。

表1 活性成分和作用靶點對接結(jié)果

圖3 活性成分與靶點對接結(jié)果

3 討論

網(wǎng)絡藥理學結(jié)果表明，在翅果菊18個活性成分中篩選得到2個活性成分（LB和GI）及其作用靶點GABRB3，并采用分子對接技術(shù)對LB和GI與GABRB3進行了對接驗證，結(jié)果表明，LB和GI均與GABRB3的11個蛋白受體有良好的結(jié)合能力。GABRB3是γ-氨基丁酸A（γ-aminobutyric acid A，GABA）受體中功能顯著的一種，而GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，研究表明GABRB3與多種神經(jīng)類疾病有關(guān)，其異常表達可引起包括抑郁癥等多種精神疾病[17-18]。辛軍彩[17]發(fā)現(xiàn)GABRB3基因是抑郁癥的一種遺傳相關(guān)基因。張嬙[18]研究發(fā)現(xiàn)GABRB3等基因的異常表達可能是導致抑郁癥的中樞機制之一，糾正該基因的異常表達則對抑郁癥具有良好的干預作用。

GO富集和KEGG通路分析表明，翅果菊及其活性成分的作用機制與γ-氨基丁酸信號通路、GABA-A受體活性、GABA-A受體復合體和GABA能突觸等聯(lián)系密切，可見GABA的水平和功能對翅果菊及其活性成分發(fā)揮抗抑郁作用具有重要意義。劉向六等[19]對抑郁癥大鼠強迫游泳模型中研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮的抗抑郁作用與大鼠前額皮層 GABA下調(diào)有關(guān)。周月等[20]采用GABA和茶氨酸聯(lián)合干預抑郁癥大鼠，給藥后對抑郁癥有一定改善作用。

本研究從分子網(wǎng)絡層面揭示LB在抑郁癥的治療中具有良好的應用前景，并分析了作用靶點和信號通路，為其作用機制的深入研究和藥理學研究應用提供了研究依據(jù)和線索。