馮秋琴 黃 歡 陳宏君 田 曼

1.廣東省珠海市婦幼保健院小兒呼吸科，廣東珠海 519000；

2.廣東省珠海市婦幼保健院兒童腦發(fā)育與康復(fù)科，廣東珠海 519000；

3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210008

毛細(xì)支氣管炎是一種下呼吸道感染性疾病，具有潛在危及生命的危險(xiǎn)，主要感染嬰幼兒，并在幾天內(nèi)出現(xiàn)咳嗽，呼吸過度，喘息等臨床表現(xiàn)[1]。在這些患兒中，住院患呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染的毛細(xì)支氣管炎嬰兒中有3%～10%出現(xiàn)呼吸衰竭[2]。另外，外周血單個(gè)核 細(xì) 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在很多炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病中紅霉素的治療依賴單個(gè)核細(xì)胞的參與作用，紅霉素可以增加單個(gè)核細(xì)胞HDAC的活性，并減少NF-kB轉(zhuǎn)錄活性及IL-8的合成[3]。蛋白質(zhì)乙?；?，是一種重要的表觀遺傳修飾模式，在宿主防御病毒感染中起著關(guān)鍵作用。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）則是通過調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-脫氧核糖核酸，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞功能[4-5]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylasesinhibitor，HDACi）目前在臨床應(yīng)用廣泛。如曲古抑制素A（trichostatin A，TSA），因其作為抗癌藥物的潛在用途而受到關(guān)注。除了具有抗癌活性之外，還表現(xiàn)出有效的抗炎特性，其治療效果已在感染性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘中得到證實(shí)[6-7]。另外，TSA被發(fā)現(xiàn)可降低丙型肝炎病毒的復(fù)制[8]。本研究旨在從動(dòng)物水平探討HDACi[代表藥物TSA及辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）]對(duì)RSV毛細(xì)支氣管炎小鼠血液PBMC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子、氧化應(yīng)激因子的表達(dá)影響。TSA、SAHA可能是調(diào)節(jié)RSV誘導(dǎo)的毛細(xì)支氣管炎的一種新的治療方法，為臨床新治療手段提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇40只8～10周齡的雌性BALB/c小鼠（購自南京大學(xué)動(dòng)物研究中心）；藥品TSA、SAHA均 購 自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA，批 號(hào)T20190006/S202103154）；細(xì)胞培養(yǎng)需要的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Carlsbad，CA，USA；丙二醛（MDA），一氧化氮（NO）檢測試劑盒購自Jiancheng Bioengineering Institute批號(hào)CAS542-78-9/CAS15917-77-8；白 介 素-6（IL-6）、腫 瘤 壞 死 因 子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海Ex Cell Biology Inc，批號(hào)CAS148157-34-0/CAS94948-59-1。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 本實(shí)驗(yàn)已通過我院倫理委員會(huì)審核。40只8～10周齡的雌性BALB/c小鼠，先在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃；濕度60%；12 h光照周期，給予標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飼料，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)表法將40只小鼠分為四組：正常對(duì)照組10只、RSV處理組10只、TSA+RSV處理組10只、SAHA+RSV處理組10只。所有動(dòng)物研究均按照NIH指南進(jìn)行[12]，在異氟烷輕度麻醉下，用PBS注射入對(duì)照組10只小鼠鼻內(nèi)，再向處理組30只小鼠鼻內(nèi)接種RSV病毒（5×105 PFU），處理組每組10只小鼠共30只，通過離體噬斑測定確認(rèn)RSV感染。TSA+RSV處理組、SAHA+RSV處理組在RSV注射后的當(dāng)天、注射后第1天和注射后第2天，將TSA[0.5 mg/（kg·d）]和SAHA[25 mg/（kg·d）]1 ml腹腔內(nèi)注射3 d，藥物滿3 d后處死小鼠，對(duì)照組10只小鼠這3 d腹腔注射生理鹽水1 ml作對(duì)照處理。

1.2.2 應(yīng)用Q-PCR測定HDACi對(duì)RSV病毒復(fù)制的影響 四組動(dòng)物均在藥物處理3 d后處死小鼠，提取小鼠肺組織，通過測量RSV-病毒載量，使用RT-qPCR定量肺組織中RSV-L基因表達(dá)的水平。

1.2.3 PBMC的獲取 四組均在藥物處理3 d后處死小鼠，提取小鼠肺泡灌洗液2 ml，同時(shí)取肺組織備用。血液取后應(yīng)用肝素抗凝，與等量PBS混勻。在離心管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液（使用前需恢復(fù)至室溫，淋巴細(xì)胞分離液與血樣1∶1）。用滴管將血樣沿管壁緩慢疊加于分層液面上，保持清楚的界面。室溫水平離心后管內(nèi)分為3層，在上、中層界面處有一個(gè)以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，用吸管直接吸取，并重復(fù)洗滌2次，得到外周血PBMC。

1.2.4 PBMC的培養(yǎng) 將獲得的四組小鼠的外周血PBMC以含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸至1×106個(gè)/ml，培養(yǎng)于24孔板中，每孔1 ml，加入植物血凝素，終濃度為50 mg/L，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后留取細(xì)胞培養(yǎng)液，留待測定上清液中炎癥因子和氧化應(yīng)激分子表達(dá)水平。

1.2.5 酶聯(lián)免疫ELISA檢測炎癥因子、氧化應(yīng)激因子水平 體外培養(yǎng)四組PBMC細(xì)胞，24 h后留取上清液，通過ELISA測量促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平；測定氧化應(yīng)激相關(guān)分子MDA和NO的水平。

1.2.6 組織病理學(xué)分析 四組動(dòng)物藥物處理3 d后，處死小鼠，用2×0.5 ml等份預(yù)冷的PBS灌注肺部，隨后將肺組織固定在10%福爾馬林溶液中并包埋在石蠟中，在載玻片上切割石蠟切片（4 μm），用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察病理損傷的程度。

2 結(jié)果

2.1 HDACi藥物TSA、SAHA可以抑制RSV復(fù)制

使用PCR技術(shù)檢測肺部RSV病毒載量，將RSV感染的小鼠暴露于HDACi藥物TSA、SAHA后病毒載量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見表1。

表1 各組RSV病毒載量比較（copies/ml）

2.2 TSA、SAHA可以抑制RSV誘導(dǎo)的毛細(xì)支氣管炎小鼠模型中PBMC炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激因子的釋放

為確定HDAC抑制劑是否影響RSV誘導(dǎo)的氣道炎癥，使用ELISA測量PBMC細(xì)胞上清液中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，結(jié)果顯示TSA或SAHA處理抑制IL-6和TNF-α的釋放，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見表2。另外，氧化應(yīng)激相關(guān)因子NO水平有下降趨勢；MDA的水平在藥物處理后也明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見表3。

表2 各組促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α釋放水平比較（pg/ml，x ± s）

表3 各組氧化應(yīng)激相關(guān)分子NO、MDA釋放水平比較（x ± s）

2.3 組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、SAHA可以減輕RSV病毒引起的肺損傷

光學(xué)顯微鏡下觀察四組小鼠肺部病理損傷的程度，結(jié)果顯示RSV處理組炎癥浸潤情況明顯高于對(duì)照組，表現(xiàn)為支氣管周圍、血管周圍及肺泡中明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，TSA+RSV處理組及SAHA+RSV處理組肺部炎癥浸潤情況較RSV組明顯減輕，其中SAHA+RSV組炎癥抑制作用表現(xiàn)得更明顯（圖1）。提示HDACi在RSV感染肺部中起到明顯的抗炎作用。

圖1 四組小鼠肺組織HE染色評(píng)估氣道炎癥的嚴(yán)重程度和肺損傷的情況比較

3 討論

目前對(duì)于RSV的病理機(jī)制研究有很多，但尚不明確，其中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是RSV感染后出現(xiàn)不同臨床癥狀的個(gè)體，有些人只有輕微的感冒癥狀，不需要特殊治療，而在另一些人中，RSV感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，包括毛細(xì)支氣管炎或肺炎，嚴(yán)重時(shí)甚至威脅生命[9]。

組蛋白去乙?；窰DACs在基因表達(dá)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，它通過乙?；腿ヒ阴；M蛋白來調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，有研究證實(shí)組蛋白乙酰化控制某些病毒的感染[10]。在感染人類的諸多病原體中，HDACs與病毒復(fù)制和發(fā)病有關(guān)，包括皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、柯薩奇病毒、乙型丙型肝炎、HCV和人類免疫缺陷病毒HIV-1[11]。如在丙肝病毒感染期間，HDACi類藥物SAHA通過改變宿主細(xì)胞中基因（如OPN和Apo-A1）的表達(dá)而對(duì)HCV復(fù)制發(fā)揮抑制作用。本研究探究組蛋白乙?；欠裨赗SV復(fù)制和病毒誘導(dǎo)的氣道炎癥的調(diào)節(jié)中起作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，HDACs中HDAC2的異常表達(dá)在肺部參與介導(dǎo)了嚴(yán)重哮喘或慢性阻塞性肺疾病患者的甾體抗性作用[12]，但具體參與機(jī)制尚未研究。另外，外周血單個(gè)核細(xì)胞已證實(shí)在很多炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，基于這些研究基礎(chǔ)，本研究提示，用HDACi處理RSV感染的小鼠，RSV病毒的復(fù)制被抑制。

HDACi在體外和體內(nèi)均發(fā)揮抗炎作用。HDACi類藥物TSA可減輕過敏性哮喘小鼠模型中的炎癥[13]，使用HDACi減輕了脂多糖誘導(dǎo)的急性小鼠肺損傷[14]。本研究表明，使用TSA、SAHA可顯著減輕RSV誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生IL-6和TNF-α的釋放，IL-6和TNF-α的表達(dá)降低可以解釋HDACis處理后毛細(xì)支氣管炎小鼠模型中中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤的減少。

另外，氧化應(yīng)激相關(guān)因子參與多種形式的組織損傷，包括對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分的損害[15]。在本研究中，RSV感染的小鼠的肺中NO，MDA顯著增加，而HDACi逆轉(zhuǎn)了這一過程。

總之，本研究探討了HDACi在抑制RSV感染、調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的氣道炎癥中的功能和參與的相關(guān)機(jī)制。未來需進(jìn)行藥物臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步明確和驗(yàn)證去乙?；敢种苿〩DACi在RSV誘導(dǎo)的患者氣道炎癥中的作用情況和參與的相關(guān)機(jī)制，為HDACi類藥物將來進(jìn)入臨床治療呼吸道疾病提供重要的數(shù)據(jù)支持。