弓玉祥，陳平圣, *，倪海鋒，伍敏，楊旻宇

（1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎臟病研究所；2東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，南京 210009）

淀粉樣物質(zhì)是一種異常蛋白質(zhì)，呈均勻纖維狀，難以降解，是多種原因引起的蛋白質(zhì)代謝障礙。該物質(zhì)常沉積在血管壁和血管周?chē)Y(jié)締組織中，累及多個(gè)器官，產(chǎn)生多種臨床癥狀和體征，及早診斷與治療，能提高患者的生存率和生活質(zhì)量。目前剛果紅及氧化剛果紅染色是鑒定淀粉樣物質(zhì)的金標(biāo)準(zhǔn)，常用石蠟切片制作而成[1,2]。淀粉樣變性腎病發(fā)病率逐漸升高，隨之腎穿刺活檢標(biāo)本的剛果紅染色也逐漸增多，這就要求石蠟切片盡量有腎小球，因?yàn)榈矸蹣游镔|(zhì)在腎小球沉積最常見(jiàn)。但是，臨床上經(jīng)常遇到石蠟組織沒(méi)有腎小球的情況，而用于熒光染色的冰凍切片中有腎小球，那么能否用冰凍切片代替石蠟切片來(lái)進(jìn)行剛果紅染色呢？為此我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)摸索建立了冰凍切片剛果紅及氧化剛果紅染色方法，取得了較好的效果。

材料與方法

1 臨床資料

收集2013年1月至2021年12月以來(lái)東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科住院患者及外院送檢腎穿標(biāo)本，經(jīng)病理診斷為淀粉樣變性腎病。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

0.5%剛果紅（上海幫景實(shí)業(yè)有限公司）染液（用80%甲醇、20%甘油配制0.5%剛果紅染液），0.2%氫氧化鉀溶液，蘇木素（京奧多福尼生物科技有限公司），1%過(guò)碘酸，3%六次甲基四胺，2%硝酸銀，5%硼砂，0.2%氯化金，5%硫代硫酸鈉，麗春紅染液（麗春紅和酸性復(fù)紅），1%磷鉬酸，2%苯胺藍(lán)，1%鹽酸乙醇，1%氨水乙醇，戊二醛，無(wú)水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，二甲苯，中性樹(shù)膠，5%高錳酸鉀，0.3%硫酸，5%草酸。所有試劑均為分析純。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

冰凍切片機(jī)（CM1510，徠卡公司），超薄切片機(jī)（EM UC7，徠卡公司），透射電鏡（HT7700，日立公司），正置生物顯微鏡（DMLS，徠卡公司），偏光顯微鏡（DM750，徠卡公司）。

4 標(biāo)本制備

石蠟切片（包括實(shí)驗(yàn)片、陽(yáng)性對(duì)照片和陰性對(duì)照片）、超薄切片、已在日常診斷工作中制備完成，在本實(shí)驗(yàn)中不再重復(fù)制備。用于剛果紅染色的石蠟切片厚4 μm，冰凍切片厚5 μm 。

5 染色方法

5.1 冰凍切片組織固定

同一例冰凍切片分別置于4%甲醛中1.5 min、無(wú)水酒精中1.5 min、Bouin液1.5 min固定，取出水洗4 min左右，以便找出最佳固定方法。

5.2 剛果紅染色

將陽(yáng)性對(duì)照片、陰性對(duì)照片和實(shí)驗(yàn)切片放置于剛果紅染液15 min，水洗；氫氧化鉀溶液1 min，水洗；蘇木素染液2 min，水洗；1%鹽酸酒精，數(shù)秒；1%氨水酒精數(shù)秒，水洗；80%酒精數(shù)秒一次；95%酒精數(shù)秒2次；無(wú)水酒精數(shù)秒2次；二甲苯數(shù)秒2次?？焖倜撍?、透明，中性樹(shù)膠封片。

5.3 氧化剛果紅染色

5%高錳酸鉀與0.3%硫酸1:1混合，處理切片3 min，水洗；5%草酸處理1 min，水洗；然后放置于剛果紅染液15 min，以下步驟同上至封片。

5.4 過(guò)碘酸-六胺銀（periodic acid-silver methenamine, PASM）染色

1%過(guò)碘酸處理切片10 min，水洗后，置工作液（3%六次甲基四胺25 mL+2%硝酸銀3 mL+5%硼砂2 mL）35 min后，水洗；加0.2%氯化金覆蓋2 min后水洗；置5%硫代硫酸鈉1 min后水洗；麗春紅10 min后，水洗；1%磷鉬酸1min后，直接置于2%苯胺藍(lán)4 min后水洗；梯度乙醇脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

6 透射電鏡標(biāo)本制備與電鏡觀察

腎穿刺組織以2.5%戊二醛4 ℃初固定4 h，PBS洗去固定液后以1%四氧化鋨4 ℃再固定2 h；梯度乙醇中連續(xù)脫水，再用丙酮置換乙醇；浸透劑處理組織30 min，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，放入60 ℃烤箱聚合24 h；超薄切片機(jī)切片（厚60～70 nm）；切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后電鏡觀察、拍照記錄。

結(jié) 果

從2013年至2021年的8937例腎活檢中檢出淀粉樣變腎小球病109例，占1.22%。109例石蠟切片PAS染色均見(jiàn)腎小球內(nèi)多少不等的淺紅色團(tuán)塊狀物質(zhì)沉積，其中49例見(jiàn)小動(dòng)脈壁和間質(zhì)陽(yáng)性沉積。PASM染色顯示腎小球毛細(xì)血管基底膜不規(guī)則增厚，多數(shù)病例見(jiàn)睫毛狀改變，剛果紅染色見(jiàn)團(tuán)塊狀物著磚紅色。電鏡下見(jiàn)腎小球系膜區(qū)、上皮下及內(nèi)皮下淀粉樣纖維沉積，直徑7～12 nm，僵硬無(wú)分支，雜亂無(wú)序排列（圖1）。未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性染色。

圖1 淀粉樣變性腎病常規(guī)病理檢查方法。A，PAS染色；B，PASM染色；C，剛果紅染色（石蠟切片）；D，透射電鏡Fig.1 Routine pathological examining methods of amyloidosis nephropathy. A, PAS staining; B, PASM staining; C, Congo red staining (paraffin sections); D, transmission electron microscopy

實(shí)驗(yàn)顯示不論是石蠟切片還是冰凍切片，剛果紅染色均能顯示組織中沉積的淀粉樣物。石蠟切片組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)易辨認(rèn)；冰凍切片組織結(jié)構(gòu)松散，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)較難辨認(rèn)，但淀粉樣物色彩更艷麗（圖2）。

圖2 石蠟切片剛果紅染色（A）與冰凍切片（未固定）剛果紅染色（B）比較。Fig. 2 The comparison of Congo red staining between paraffin sections (A) and frozen sections (B)

冰凍切片剛果紅染色后，偏光顯微鏡觀察，可見(jiàn)蘋(píng)果綠色折光（圖3）。冰凍切片經(jīng)無(wú)水乙醇、甲醛、Bouin液固定后，再行剛果紅染色，結(jié)果顯示除甲醛外，兩種處理方法均可滿意呈現(xiàn)淀粉樣物，其中無(wú)水乙醇處理使染色更鮮艷， Bouin液處理后，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰、色彩亦較艷麗，冰凍切片乙醇固定后氧化剛果紅染色也可診斷（圖4）。

圖3 冰凍切片剛果紅染色（A），同一切片在偏光鏡下見(jiàn)蘋(píng)果綠色折光（B）Fig. 3 Congo red staining (A) and polariscopy (B) of frozen sections. Apple green refraction is visible in the same structure stained by Congo red staining

圖4 不同固定液對(duì)染色結(jié)果的影響比較。A，未固定；B，乙醇；C，Bouin液；D，氧化剛果紅染色（乙醇固定）Fig.4 The effects of fixative solutions on staining. A, no fixation; B, ethanol fixation; C, fixation with Bouin solution; D, ethanol fixation for oxidized Congo red staining

回顧性研究顯示，109例石蠟切片與相應(yīng)冰凍切片剛果紅染色和氧化剛果紅染色陽(yáng)性率完全一致，但石蠟切片和冰凍切片保存的時(shí)間愈久，染色效果愈差。

討 論

本室從2013年至2021年的8937例腎活檢中檢出淀粉樣變腎小球病109例，占1.22%，國(guó)內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道為0.89%[4,5]，國(guó)外報(bào)道為1.3%～2.9%[3]，可見(jiàn)國(guó)內(nèi)本病發(fā)生率較國(guó)外略低。由于這類(lèi)疾病的難治性和預(yù)后不良，只有及早診斷治療才可以提高生存質(zhì)量和存活率。

盡管淀粉樣物也可以沉積在腎血管壁和腎間質(zhì)，但腎小球內(nèi)沉積更多見(jiàn)，所以腎穿刺組織內(nèi)有無(wú)腎小球?qū)τ诒静〉拇_診就顯得很重要。新鮮腎活檢組織通常分為3份，1份做冰凍切片，用于免疫熒光染色；1份做石蠟切片，用于HE、PAS、PASM、Masson和剛果紅染色；1份做超薄切片，用于電鏡觀察。石蠟切片中一旦無(wú)腎小球，對(duì)病理診斷影響甚大，利用冰凍切片補(bǔ)救顯然很有必要。

用冰凍切片成功進(jìn)行剛果紅和氧化剛果紅染色，不僅提高了病理診斷的準(zhǔn)確率，也為臨床醫(yī)生減少了腎穿刺風(fēng)險(xiǎn)。盡管組織結(jié)構(gòu)的輪廓和清晰度遜于石蠟切片，但完全滿足診斷需要，而且本染色法還有節(jié)省時(shí)間及試劑的優(yōu)點(diǎn)。用冰凍切片做剛果紅染色從新鮮組織到完成制片（切片時(shí)間、染色時(shí)間和封片）只需35～40 min，而用石蠟切片做剛果紅染色從組織固定開(kāi)始到完成制片（從4%中性甲醛固定、梯度酒精脫水透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、染色、封片）最短也必須要9 h 35 min左右。

我們發(fā)現(xiàn)冰凍切片不固定即可用于剛果紅染色，但用無(wú)水乙醇或Bouin液固定后染色效果相對(duì)較好。新鮮組織最好用生理鹽水浸濕的紗布包裹送檢，否則影響制片效果。同時(shí)此方法也可以用在皮膚、血管等其他組織的剛果紅染色。

綜上所述，由于剛果紅染料與淀粉樣物質(zhì)可以特異性結(jié)合，所以剛果紅染色在診斷淀粉樣變性方面的價(jià)值可以和電子顯微鏡媲美[2]。國(guó)外學(xué)者曾報(bào)道[6]冰凍切片剛果紅熒光染色，我們?cè)谄浠A(chǔ)上進(jìn)行了改良，先用無(wú)水乙醇或Bouin液固定，再做剛果紅及氧化剛果紅染色，染色效果理想。目前國(guó)內(nèi)外其他單位尚未開(kāi)展此項(xiàng)工作。本方法具有耗時(shí)少、成本低、方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以做常規(guī)染色，避免漏診，值得推廣。