劉斌*，劉向陽(yáng)，詹新立，王國(guó)平

（1湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，長(zhǎng)沙 410005；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病科，南寧 530021）

骨肉瘤（osteosarcoma, OS）是一種好發(fā)于兒童和青少年的常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其發(fā)病率在所有類型的原發(fā)性骨腫瘤中排名第一[1]。骨肉瘤惡性程度高，易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，很多患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或者進(jìn)入晚期，因此臨床治療困難。目前，盡管骨肉瘤患者的5年生存率得到了較大提高，但遠(yuǎn)期生存率仍處于較低水平。因此，深入研究骨肉瘤增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制、探索新的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是指長(zhǎng)度在200~100000 nt的無(wú)編碼功能的RNA，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在多種腫瘤的病理機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用[2-4]。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中骨肉瘤患者的臨床數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法分析篩選出與致病相關(guān)的LncRNA，繼而用骨肉瘤細(xì)胞系MG63及U2OS進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探索骨肉瘤增殖遷移的分子機(jī)制，為靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

人成骨細(xì)胞系HfoB1.19和骨肉瘤細(xì)胞株MG63、U2OS（武漢普諾賽生命科技公司）；Mc-Coy’5A培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；1%雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）、胰蛋白酶（武漢普諾賽生命科技公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（東仁化學(xué)科技公司）；兔抗SphK1抗體（Abcam公司）、兔抗Caspase-3抗體（Proteintech公司）、兔抗mTOR抗體（Proteintech公司）、兔抗p-mTOR抗體（Affinity公司）、小鼠抗GAPDH抗體（普健生物科技公司）和辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）特異性siRNA（si-MALAT1）及對(duì)照siRNA (si-NC)（上海吉瑪公司）；RNA提取試劑盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Takara公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser perfect Real time, Takara公司）；熒光定量試劑（light cycler 480 SYBR Green I Master, Roche公司）；凋亡檢測(cè)試劑盒A211-02（南京諾唯贊生物科技公司）。

2 生物信息學(xué)分析

使用R軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)集GSE14359進(jìn)行差異基因的篩選和數(shù)據(jù)可視化，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05 &|logFC|>2。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE21257數(shù)據(jù)集的芯片數(shù)據(jù)（有生存信息的骨肉瘤樣本53例），利用R語(yǔ)言survminer package進(jìn)行MALAT1的生存分析。

3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含有10%滅活胎牛血清和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，隔天換液，所有細(xì)胞置于37℃（成骨細(xì)胞HfoB1.19，34℃），含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX Reagent將si-NC、si-MALAT1轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4~6h后更換新鮮完全培養(yǎng)基。細(xì)胞分組包括：骨肉瘤細(xì)胞組、HfoB1.19組、NC siRNA組和LncRNA-MALAT1 siRNA組。

4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集各組細(xì)胞，按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。采用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行RT-qPCR。其反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s，退火60 ℃，15 s，延伸72 ℃，20 s，共40個(gè)循環(huán)，采用2?ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。所用到的PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR的引物序列Tab. 1 Primer sequences for PCR

5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞以5000個(gè)/孔（96孔板）進(jìn)行鋪板，每組3個(gè)重復(fù)，5% CO2，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d后，每孔加入CCK8試劑， 37 ℃孵育4 h后加入終止液，再用全功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值（OD450）。

6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前先用記號(hào)筆在6孔板背面畫(huà)橫線標(biāo)記；細(xì)胞消化后接入6孔板，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜；細(xì)胞鋪滿板底后，用10 μL槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致；吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，拍照記錄；將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0 h、6 h、24 h、48 h分別取出拍照；根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

7 細(xì)胞周期檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后收集骨肉瘤細(xì)胞，PBS洗滌，加入70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜。再次PBS洗滌、去除乙醇，加入DNA染液碘化丙啶（PI）并上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞周期檢測(cè)用流式細(xì)胞儀（CytoFLEXS）進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用軟件CytExpert 2.3進(jìn)行收集和分析。

8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞凋亡檢測(cè)按照凋亡檢測(cè)試劑盒A211-02 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。siRNA轉(zhuǎn)染后收集骨肉瘤細(xì)胞并用PBS洗滌；加結(jié)合緩沖液稀釋，取100 μL重懸；加入5 μL Annexin V-FITC；加入5 μL PI，室溫避光15 min；再補(bǔ)加150 μL Binding Buffer后上機(jī)檢測(cè)。

9 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白的濃度，根據(jù)裂解液的體積加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。然后用10%的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用含5%奶粉的TBST封閉1 h后，PVDF膜在抗SphK1（1︰1000）、抗Caspase-3（1︰1000）、抗p-mTOR（1︰500）或抗GAPDH（1︰5000）一抗中4 ℃孵育過(guò)夜。第二天用PBST洗滌3次后，將PVDF膜放入稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（1︰5000）中室溫孵育1 h。最后用ECL顯像，用ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，GAPDH 作內(nèi)參。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用ANOVA檢驗(yàn)法分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MALAT1在骨肉瘤中高表達(dá)并與生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE14359數(shù)據(jù)集的芯片數(shù)據(jù)（非轉(zhuǎn)移骨肉瘤數(shù)據(jù)10例，正常樣本2例），對(duì)GSE14359進(jìn)行差異表達(dá)分析，并繪制火山圖和熱圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常樣本相比，共有536個(gè)基因在骨肉瘤中差異表達(dá)，其中299個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，237個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1A，B）。MALAT1的表達(dá)明顯增高（圖1C）。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE21257數(shù)據(jù)集的芯片數(shù)據(jù)（有生存信息的骨肉瘤樣本53例），進(jìn)行MALAT1的生存分析。結(jié)果表明，MALAT1的表達(dá)量與骨肉瘤患者的生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)量越高、患者生存預(yù)后越差（圖1D）。

圖1 骨肉瘤差異基因分析及MALAT1的生存分析。A，骨肉瘤差異基因熱圖分析；B，骨肉瘤差異基因火山圖分析；C，MALAT1在骨肉瘤及正常組織中的表達(dá)比較；D，MALAT1的Kaplan-Meier生存分析Fig. 1 Differential gene analysis of osteosarcoma and survival analysis of MALAT1. A, heat map analysis of differential genes in osteosarcoma; B,volcanic map analysis of differential genes in osteosarcoma; C, expression of MALAT1 in osteosarcoma and normal tissues; D, Kaplan‐Meier survival analysis of MALAT1.

2 骨肉瘤細(xì)胞系中MALAT1高表達(dá)

為了探索骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的變化情況，本研究比較了骨肉瘤細(xì)胞系和成骨細(xì)胞系中MALAT1的表達(dá)量。RT-qPCR檢測(cè)顯示，與成骨細(xì)胞HfoB1.19相比，骨肉瘤細(xì)胞系MG63及U2OS中MALAT1的表達(dá)均明顯升高（圖2A）。Si-MALAT1組骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)明顯低于空白組及陰性對(duì)照組，證明SiRNA成功抑制了MALAT1的表達(dá)（圖2B）。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平。A，成骨細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與HfoB1.19組比較：**P<0.01，n=3。B, Si-MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系中MALAT1表達(dá)的影響；與空白組及陰性對(duì)照組比較：**P<0.01，n=3Fig. 2 RT-qPCR determination of MALAT1 expression level. A, statistical analysis of MALAT1 expression level in osteoblasts and osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with HfoB1.19 group; n=3. B, effect of Si‐MALAT1 on MALAT1 expression in osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with blank group or negative control group; n=3

3 MALAT1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖

為了明確MALAT1表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，應(yīng)用CCK-8法比分析了MALAT1表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與Si-NC組相比， Si-MALAT1處理的MG63細(xì)胞增殖能力明顯受抑制（圖3A），在U2OS骨肉瘤細(xì)胞系中有相似結(jié)果（圖3B）。由此說(shuō)明MALAT1具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖的能力。

圖3 MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖影響的CCK-8法分析。A, 抑制MALAT1表達(dá)對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響；與si-MALAT1組比較：**P<0.01；n=3。B，抑制MALAT1表達(dá)對(duì)U2OS骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響；與si-MALAT1組比較：**P<0.01；n=3Fig. 3 The effect of MALAT1 on the proliferation of osteosarcoma cells. A, effect of MALAT1 inhibition of MALAT1 expression on the proliferation of MG63 osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with si‐MALAT1 group; n=3. B, effect of MALAT1 inhibition of MALAT1 expression on the proliferation of U2OS osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with si-MALAT1 group; n=3

4 MALAT1增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力

為了明確MALAT1表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的關(guān)系，應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)分析了抑制MALAT1表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與成骨細(xì)胞HfoB1.19相比，骨肉瘤細(xì)胞系MG63及Si-NC組48 h后劃痕愈合更明顯，表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移能力；敲除MALAT1后的Si-MALAT1組骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力明顯減弱（圖4A）；在U2OS骨肉瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出類似結(jié)果（圖4B）。由此表明，MALAT1可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。

圖4 MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移影響的劃痕實(shí)驗(yàn)分析。A，抑 制MALAT1表 達(dá) 對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響；B，抑制MALAT1表達(dá)對(duì)U2OS骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響。比例尺，100 μmFig. 4 The effect of MALAT1 on the migration of osteosarcoma cells. A, scratch testing for effect of inhibition of MALAT1 expression on the migration ability of MG63 osteosarcoma cells; B. effect of inhibition of MALAT1 expression on the migration ability of U2OS osteosarcoma cells. Scale bar, 100 μm

5 MALAT1抑制細(xì)胞凋亡降低細(xì)胞G0/G1期百分比

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較了抑制MALAT1表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比，敲除MALAT1后MG63和U2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡比率明顯增加（圖5A-C），G0/G1期百分比顯著升高（圖5D，E）。由此表明，MALAT1可抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖。

圖5 MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期及凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)分析。A，凋亡率代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B和C，抑制MALAT1表達(dá)對(duì)MG63和U2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡率影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。D，細(xì)胞周期代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；E和F，抑制MALAT1表達(dá)對(duì)MG63和U2OS骨肉瘤細(xì)胞周期影響的同統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與NC si-MALAT1組比較：*P<0.05；**P<0.01；n=3Fig. 5 Flow cytometry analysis for effect of MALAT1 on cell cycle and apoptosis of osteosarcoma cells. A, representative flow cytometry analysis of apoptosis rate; B and C, statistical analysis for the effect of MALAT1 expression inhibition on the apoptosis of MG63 and U2OS osteosarcoma cells.D, representative flow cytometry analysis of cell cycle; E and F, statistical analysis for the effect of MALAT1 expression inhibition on the cell cycle of MG63 and U2OS osteosarcoma cells. *P<0.05 and **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group; n=3

6 MALAT1降低Caspase-3表達(dá)升高SphK1和pmTOR表達(dá)

為了進(jìn)一步明確MALAT1與骨肉瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)了MALAT1表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63及U2OS中MALAT1表達(dá)可使激活型Caspase-3水平明顯升高，而SphK1和p-mTOR水平顯著降低， p-mTOR/mTOR比例降低（圖6，7）。這些結(jié)果提示MALAT1可通過(guò)降低Caspase-3水平、升高SphK1和p-mTOR水平抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

圖6 MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63與凋亡相關(guān)蛋白水平影響的Western blot分析。A, 抑制MALAT1表達(dá)對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞中Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平影響的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果。B，Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與NC si-MALAT1組比較：**P<0.01（n=3）Fig. 6 Western blot detection for the effect of MALAT1 on the expression of apoptosis related proteins in the osteosarcoma MG63 cells. A, representative results of Western blot analysis of the levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR. B, statistical analysis of levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR; **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group (n=3)

討 論

近年來(lái)的研究表明，LncRNA在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要的調(diào)控作用。對(duì)LncRNA的表達(dá)調(diào)控可以改變腫瘤的生物學(xué)行為，因此LncRNA可作為腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)[5,6]。MALAT1失調(diào)在骨肉瘤中也有報(bào)道[7]，骨肉瘤中MALAT1表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)不同信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為[7-10]，是骨肉瘤預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立影響因素[11]。但是，MALAT1對(duì)于骨肉瘤調(diào)控的具體分子機(jī)制尚未完全明確，MALAT1對(duì)骨肉瘤凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)包括MALAT1在內(nèi)的多種LncRNA在骨肉瘤中高表達(dá)，并與患者的生存率密切相關(guān)，提示MALAT1可能在骨肉瘤增殖轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了調(diào)控作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，敲除MALAT1后與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果表明，與HfoB1.19成骨細(xì)胞相比，骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1表達(dá)明顯升高，MALAT1可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移并抑制細(xì)胞凋亡；而敲除MALAT1可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并增加細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果都表明，MALAT1能促進(jìn)骨肉瘤的惡性行為。

圖7 MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS與凋亡相關(guān)蛋白水平影響的Western blot分析。A, 抑制MALAT1表達(dá)對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞中Caspase-3、水平抑制MALAT1表達(dá)對(duì)U2OS骨肉瘤細(xì)胞中Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平影響的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果。B，Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與NC si-MALAT1組比較：**P<0.01（n=3）Fig. 7 Western blot detection for the effect of MALAT1 on the expression of apoptosis related proteins in the osteosarcoma U2OS cells. A, representative results of Western blot analysis of the levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR in the osteosarcoma U2OS cells. B, statistical analysis of levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR; **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group ( n=3)

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的、有序的死亡。正常狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞增殖及凋亡處于平衡狀態(tài)，但腫瘤組織中凋亡受抑制，使腫瘤細(xì)胞能在機(jī)體內(nèi)增殖、擴(kuò)散。Caspase-3、SphK1、mTOR、p-mTOR在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用。本研究表明，敲除MALAT1能促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，抑制SphK1和p-mTOR的表達(dá)，并降低p-mTOR/mTOR比例。說(shuō)明MALAT1過(guò)表達(dá)可能是通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)通路、抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)其增殖和遷移的。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，MALAT1對(duì)骨肉瘤的生物學(xué)行為的影響有待于進(jìn)一步從動(dòng)物水平及更深入的分子水平進(jìn)行研究。

綜上所述，MALAT1能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)通路、抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖遷移等生物學(xué)行為，并與骨肉瘤患者的臨床生存率密切相關(guān)，可作為骨肉瘤靶向治療的潛在生物靶點(diǎn)。