董鉦浩，董文康，張淼，黃泳淇，黃倩雨，鄒焜，鐘詩雯，扶玉珍，暴凱敏，任翔*，孔慧*

（1大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連 116023；2大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，大連 116044；3湖北醫(yī)藥學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，十堰 442000）

糖尿病是一組以持續(xù)性高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病[1]。 當(dāng)機體長期處于慢性高血糖環(huán)境將會導(dǎo)致不同器官損傷及功能障礙。糖尿病性耳聾是以耳蝸毛細胞散在缺失及退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯母幸羯窠?jīng)性耳聾，多呈進行性發(fā)展，病程緩慢且不可逆[2,3]。臨床主要表現(xiàn)為雙耳高頻聽力下降，偶爾可以以突發(fā)性耳聾的形式出現(xiàn)，可伴眩暈，前庭功能減退等[4]。多數(shù)患者就醫(yī)時已出現(xiàn)聽力不可逆性損害，嚴重影響糖尿病人群的生活質(zhì)量，因而明確糖尿病性耳聾早期診斷、治療及預(yù)防成為近年研究的熱點。有研究表明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等參與糖尿病耳聾的發(fā)生發(fā)展過程[5]。

硫氧還蛋白（thioredoxin, Trx）是一種存在于機體內(nèi)的小分子抗氧化蛋白，分子量約為12 kDa，Trx通過活性位點中Cys的二硫鍵和巰基的互變來實現(xiàn)氧化還原調(diào)節(jié)功能[6]。NF-E2-相關(guān)因子2（NF-E2-related factor-2, Nrf2）是影響抗氧化反應(yīng)元件（ARE）介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的核心蛋白[7]。 Nrf2通常與Keap1結(jié)合位于胞質(zhì)中，激活后解離并易位至胞核中，與ARE序列結(jié)合而增強抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[8]。Erk家族是一組可傳導(dǎo)有絲分裂信號的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[9]。Erk通常位于細胞質(zhì)中，激活后易位進入細胞核并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性和基因表達，Erk1和Erk2是Erk/MAPK 途徑的重要成員[10]，與細胞增殖和分化密切相關(guān)[11,12]。

蘿卜硫素（sulforaphane, SF）是廣泛存在于西藍花等十字花科植物中的異硫氰酸鹽，在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為萊菔硫烷后通過激活Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激功能[13]。已有研究顯示SF作為抗氧化誘導(dǎo)劑可通過上調(diào)Trx的表達而延緩Tub基因突變小鼠耳蝸毛細胞的退行性變[14]，但對糖尿病小鼠耳蝸毛細胞的影響及其相關(guān)機制還未完全闡明。因此，本研究以糖尿病小鼠為模型，明確SF對糖尿病小鼠耳蝸毛細胞退行性變的保護作用機制，為臨床防治糖尿病性耳聾提供新的指導(dǎo)方向。

材料與方法

1 實驗動物

選擇20只健康Balb/c小鼠（購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，室溫20~25 ℃，濕度50%~60%，每12 h定點喂養(yǎng)。

2 主要試劑及儀器

蘿卜硫素（L-suforaphane, SF）（加拿大Toronto Research Chemicals公司），鏈尿佐菌素（STZ）（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），Trx抑制劑PX-12（R&D），兔抗Trx抗體（Proteintech），兔抗GAPDH抗體（Proteintech），兔p-Erk1/2抗體（Cell Signaling），兔抗Nrf2抗體（Proteintech），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Proteintech），Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abbkin），ECL發(fā)光化學(xué)試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），DAPI染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；三諾安穩(wěn)型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司），SMZ-168解剖顯微鏡（德國Motic公司），VCX130超聲粉碎儀（SONICS Vibra Cell），酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）；Bio-Rad Universal Hood Ⅱ成像分析儀（BIO RAD）。

3 糖尿病模型建立及實驗分組

將20只小鼠隨機分為正常對照組（NC），糖尿病組（DM），DM+SF組，DM+SF+PX12組，每組5只。正常對照組給與基礎(chǔ)飼料，其他組給與高脂飼料飼養(yǎng)。各組飼養(yǎng)4周后均禁食12 h，DM組給與腹腔注射STZ（40 mg/kg），7 d后重復(fù)注射一次。NC組給與腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于第二次STZ注射后每隔5 d測定小鼠尾靜脈血糖值，當(dāng)空腹血糖值≥7.8 mmol/L，則視糖尿病小鼠建模成功[15]。建模成功后，每日上午9:00對DM+SF組及DM+SF+PX12組小鼠分別腹腔注射用PBS溶解的SF（1.0 mg/kg）和SF+PX12（各1.0 mg/kg）（PX12先用DMSO溶解為0.1 mol/L后再用PBS溶解），注射連續(xù)15 d。對照組腹腔注射等體積生理鹽水。

4 耳蝸SDH組織化學(xué)染色

小鼠麻醉后取出耳蝸，去除蝸殼后放入裝有0.1% NBT 工作液（現(xiàn)配）的小皿中，用細針尖挑破圓窗膜并摘除鐙骨，開放前庭窗和圓窗。從蝸頂鉆一小孔，以NBT工作液進行耳蝸蝸管內(nèi)灌注。將灌注后的耳蝸置于37 ℃ NBT工作液中孵育1 h，隨后置于10%福爾馬林內(nèi)室溫固定2 d，之后將耳蝸放于7% EDTA二鈉脫鈣液（pH6.9）中，直到耳蝸軟化。

5 耳蝸基底膜鋪片

用耳蝸鑷去除蝸尖附近的耳蝸骨壁，依次分離螺旋韌帶、基底膜和外側(cè)壁組織，最后將基底膜與蝸軸分離。將基底膜轉(zhuǎn)移到滴有甘油的載波片上，于體式顯微鏡下分段鋪平，保證其外側(cè)處于同一方向，覆蓋蓋玻片以中性樹脂封片。

6 硫氧還蛋白免疫熒光染色

小鼠耳蝸組織經(jīng)石蠟包埋制成石蠟切片，后將石蠟切片經(jīng)烘箱60 ℃烘烤2 h，脫蠟水化，之后用pH6.0檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)5 min，蒸餾水浸泡冷卻至室溫，PBS清洗3遍。濾紙吸干周圍水分，蠟筆圈畫組織。0.5%的Triton X-100室溫孵育30 min，PBS清洗3遍，每次3 min。3% H2O2孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗3×3 min。滴加山羊血清工作液室溫孵育30 min。于組織區(qū)域滴加配制好的Trx抗體（1:200），放入濕盒4 ℃冰箱過夜孵育。次日，棄掉一抗，PBS清洗3次，每次3 min。濾紙吸干組織周圍液體，滴加Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:1000），室溫避光孵育1 h。PBS清洗3次，每次10 min。滴加DAPI工作液（2 μg/mL）復(fù)染細胞核，37 ℃避光孵育15 min。PBS清洗3×3 min，濾紙吸干，滴加抗淬滅劑進行封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

7 Western blot檢測耳蝸組織中相關(guān)蛋白的表達水平

建模成功后取各組小鼠耳蝸組織，分別加入100 μL蛋白裂解液，超聲粉碎后冰上靜置30 min，4 ℃下12000 r/min離心15 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白定量法測定樣品蛋白濃度，進行SDSPAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉（TTBS配制）室溫搖床封閉；分別加入抗Trx（1:1000）、Nrf2（1:1000）、 p-Erk1/2（1:1000）及抗GAPDH（1:2000）等一抗，4 ℃孵育過夜；次日取出PVDF膜置于TTBS洗膜3×15 min， HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000）室溫孵育1.5 h，TTBS洗膜3×15 min；ECL孵育后Bio-rad成像分析儀成像，通過Labwork軟件進行測定蛋白條帶光密度值，以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度比值代表相應(yīng)目的蛋白相對表達水平。

8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，并進一步應(yīng)用snk-q檢驗兩兩比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸損傷

HE染色觀察顯示，與NC組相比，DM組小鼠耳蝸外毛細胞排列松散且不規(guī)則；DM+SF組相較于DM組耳蝸毛細胞體積增大且排列相對規(guī)則；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM組與單純SF處理組相比，耳蝸毛細胞排列不規(guī)則且體積變小（圖1）。由此提示SF可能通過Trx延緩糖尿病小鼠耳蝸形態(tài)學(xué)損傷。

圖1 蘿卜硫素對糖尿病小鼠耳蝸損傷影響的HE染色觀察。比例尺，100 μmFig. 1 HE staining for the effect of suforaphane on the injury of the cochlea in diabetic mice. Scale bar, 100 μm

2 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細胞SDH活性降低和Trx表達下調(diào)

SDH組織化學(xué)染色顯示：與NC組相比較，DM組較多外毛細胞SDH活性降低或缺失，單純SF處理的DM小鼠耳蝸外毛細胞SDH活性降低或缺失明顯減少，內(nèi)毛細胞SDH活性物明顯改變；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM小鼠耳蝸外毛細胞SDH活性仍明顯降低或缺失，且內(nèi)毛細胞SDH活性也降低或缺失（圖2A—C）。免疫熒光染色顯示：DM組小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)Trx免疫反應(yīng)性較對照組明顯減弱；SF處理后，Trx免疫反應(yīng)性的降低被明顯抑制；而SF與PX12聯(lián)合后， Trx免疫反應(yīng)性仍明顯降低（圖2D）。由此進一步說明，糖尿病小鼠耳蝸外毛細胞丟失顯著，而SF可以減少糖尿病所致耳蝸毛細胞的丟失，在Trx受到抑制時，這種保護作用會相應(yīng)減弱，SF可能通過上調(diào)Trx表達對糖尿病小鼠耳蝸毛細胞發(fā)揮保護作用。

圖2 蘿卜硫素對糖尿病小鼠耳蝸毛細胞SDH活性和Trx免疫反應(yīng)性的影響。A，耳蝸毛細胞SDH活性的組織化學(xué)染色；B，內(nèi)毛細胞SDH活性缺失率統(tǒng)計學(xué)分析；C，外毛細胞SDH活性缺失率統(tǒng)計學(xué)分析；*P<0.05，***P<0.001。D，耳蝸毛細胞Trx免疫反應(yīng)性免疫熒光染色Fig. 2 The effect of suforaphane on SDH activity and Trx immunoreactivity of the cochlear hair cells of the diabetic mice. A, histochemical staining of SDH activity in the cochlear hair cells ; B, statistical analysis of SDH activity deletion rate of the inner hair cells; C, statistical analysis of SDH activity deletion rate of the outer hair cells; *P<0.05，***P<0.001. D, immunofluorescence staining for Trx immunoreactivity in the in the cochlear hair cells of the diabetes mice.

3 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細胞p-Erk1/2 /Nrf2通路活性的下調(diào)

Western blot檢測顯示：與NC組比較，DM組小鼠耳蝸組織中Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達水平顯著下調(diào)； SF作用后，Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達水平較DM組明顯升高；而SF與PX12聯(lián)合處理后，Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達水平與DM組相似，明顯低于NC組（圖3）。本結(jié)果說明SF可抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細胞p-Erk1/2 /Nrf2通路活性的下調(diào)，SF可能通過p-Erk1/2 /Nrf2抗氧化信號通路上調(diào)糖尿病小鼠耳蝸毛細胞的Trx表達。

討 論

糖尿病是一組由多病因引起以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病患者長期處于糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂，可累及腎臟、心臟、神經(jīng)血管等多組織器官，嚴重威脅患者健康[16]。糖尿病性耳聾是一種進行性發(fā)展、病程緩慢、以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性耳聾，是糖尿病常見并發(fā)癥之一。研究表明，活性氧（ROS）在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)病中起重要作用[17]。一方面，耳蝸內(nèi)的抗氧化酶類可滅活自由基使耳蝸處于自由基高代謝水平。另一方面，外毛細胞側(cè)面獨特的囊腔結(jié)構(gòu)是氧自由基的產(chǎn)生場所及受累部位。

此外有研究表明，在顱腦損傷患者中Trx在減輕損傷或抑制損傷進展方面意義重大[18]；外源性增加Trx能夠有效降低肺缺血再灌注動物模型的肺組織損傷[19]。本研究使用SF和Trx抑制劑（PX12）分別作用于DM組小鼠，采用SDH活性染色進行耳蝸毛細胞觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM組與NC組相比，外毛細胞顯著減少，內(nèi)毛細胞亦有所減少。表明糖尿病可引起耳蝸毛細胞丟失，單純給予SF處理的DM組小鼠外毛細胞丟失現(xiàn)象有所減弱；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM組與單純給予SF處理的DM組比較，小鼠外毛細胞丟失嚴重。此結(jié)果表明SF能減少因糖尿病造成的耳蝸毛細胞丟失，對耳蝸毛細胞退變起保護作用。當(dāng)Trx活性受抑制時上述保護作用隨之減弱，提示Trx在SF對糖尿病小鼠耳蝸毛細胞丟失過程中發(fā)揮保護作用過程中起到關(guān)鍵作用。

已有研究證實Nrf2-ARE途徑參與Trx及TrxR表達的調(diào)控[20]。SF作為抗氧化劑的天然誘導(dǎo)劑，通過激活p-Erk1/2 /Nrf2信號通路在糖尿病神經(jīng)退行性變中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，單純給予SF處理后能上調(diào)DM組耳蝸組織中Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達，進一步說明SF可通過作用于p-Erk1/2/Nrf2信號通路上調(diào)Trx表達。綜上所述，蘿卜硫素通過作用于p-Erk1/2 /Nrf2抗氧化信號通路介導(dǎo)糖尿病小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)Trx表達上調(diào)，對糖尿病引起的耳蝸毛細胞退行性變起到保護作用。

糖尿病導(dǎo)致機體處于一種高血糖的狀態(tài)，其會導(dǎo)致不同器官損傷及功能障礙，而氧化應(yīng)激對于糖尿病及耳蝸病變的發(fā)生起到了關(guān)鍵性的作用，高血糖導(dǎo)致體內(nèi)微環(huán)境參與氧化應(yīng)激的發(fā)生，引起ROS大量累積，體內(nèi)抗氧化酶的活性出現(xiàn)下降及下游通路的改變，從而最終引起耳蝸毛細胞的損傷和退化丟失。而大量天然植物提取物中存在著許多有效、安全的抗氧化物，因此針對其種類廣泛尋找和明確其抗氧化作用及機制對于今后進一步治療和預(yù)防糖尿病引起的感音神經(jīng)性耳聾具有重要的理論及臨床現(xiàn)實意義。