劉文濤，王新月，楊毅*，文諸縵，李云鵬，白生賓*

（1新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，烏魯木齊， 830000；2新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊 830000；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830000）

骨折是指骨結(jié)構(gòu)的連續(xù)性完全或部分斷裂[1,2]。骨折愈合是指骨折、截骨、關(guān)節(jié)融合和骨移植術(shù)后的自然骨連接的過程[3-5]。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作為一種多能干細胞，是成骨細胞的體內(nèi)來源，骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力決定成骨分化能力[6-9]。我們的前期工作在體內(nèi)植入非細胞型組織工程骨后發(fā)現(xiàn)充斥在組織工程骨中的細胞主要是炎癥細胞，其次是遷移至炎癥細胞周圍的BMSCs。已有研究證明，骨折后的炎癥微環(huán)境中的巨噬細胞可以使BMSCs發(fā)生定向遷移運動，即歸巢效應(yīng)，可以促進骨折的愈合[10-13]。炎癥微環(huán)境中，BMSCs 可調(diào)控巨噬細胞炎癥因子的釋放，以控制炎癥反應(yīng)[14]。巨噬細胞可分化為具有不同的生物學特征的亞型，包括經(jīng)典途徑活化的 M1型巨噬細胞和替代途徑活化的M2 型巨噬細胞[15-17]。我們經(jīng)查閱文獻并結(jié)合前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs調(diào)控巨噬細胞極化并不是單一通路，而呈網(wǎng)狀調(diào)控。外泌體是由活細胞分泌的直徑約為30～150 nm的小囊泡，有通訊作用，攜帶有多種蛋白質(zhì)、RNA等重要信息，BMSCs的外泌體可能參與這一網(wǎng)狀調(diào)控通路[18-22]。為了驗證BMSCs的外泌體可誘導巨噬細胞極化，本研究利用提取的BMSCs外泌體與巨噬細胞共培養(yǎng)，檢測不同濃度的外泌體對巨噬細胞內(nèi)吞作用和極化的影響，證明BMSCs的外泌體可誘導巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化。

材料與方法

1 主要材料

鼠源性巨噬細胞系RAW264.7與鼠骨髓間充質(zhì)細胞系CP-M131均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM/F12、胰蛋白酶購自美國Hyclon公司；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（均為100 U/ml） 購自武漢博士德生物工程有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自美國Abcam公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EXOSOME外泌體提取試劑盒、RNA/蛋白提取試劑盒購自上海華盈生物公司；SYBR Green Real-time PCR試劑盒購自上海索萊寶生物公司；兔抗Alix、CD63、TSG101單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；細胞質(zhì)染色試劑盒、PCR引物購自上海生工；DiI染色劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

2 細胞培養(yǎng)與處理

巨噬細胞RAW264.7與骨髓間充質(zhì)干細胞CPM131常規(guī)復蘇，加入含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于 37 °C ， 5% CO2 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當巨噬細胞RAW264.7與間充質(zhì)干細胞CP-M131生長至70%~80%時去除培養(yǎng)基并用PBS洗滌，可根據(jù)情況決定是否用0.25%胰蛋白酶消化，室溫條件下1000 r/min離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細胞后進行傳代。將巨噬細胞 RAW264.7 以 2×105細胞 / 孔的密度接種在 6 孔板上孵育 24 h。

3 外泌體的分離與鑒定

取適量骨髓間充質(zhì)干細胞CP-M131培養(yǎng)上清液，3000 g離心15 min以去除細胞及細胞碎片，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，置于冰上，按照外泌體提取試劑盒說明書將細胞培養(yǎng)上清液：試劑量（2:1）4 ℃孵育過夜后4 ℃、3000 g離心60 min，棄上清液，4 ℃預冷的PBS重懸后轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml EP管中，4 ℃、10000 g離心10 min棄上清，所得沉淀用PBS重懸后4 ℃、10000 g離心5min，取上清，所得上清即為細胞培養(yǎng)上清外泌體的PBS重懸液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 F-actin免疫熒光染色

當巨噬細胞RAW264.7達到80%的匯合時，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每次5 min，使用含3%的多聚甲醛固定細胞30 min，再次使用PBS清洗2次，每次5 min，每孔加入Alexa Fluor 488標記鬼筆環(huán)肽工作液100 μL，室溫避光孵育90 min，PBS清洗細胞3次，每次10 min。免疫熒光染色后，加入100 μL DAPI染色工作液對細胞核進行復染，室溫避光孵育5 min，用PBS清洗2次，每次5 min，激光共聚焦顯微鏡（Nikon C2+）下觀察。

5 外泌體透射電鏡觀察

取骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體10 μL滴加到碳覆膜銅網(wǎng)上，樣品吸附3 min，用濾紙吸去多余液體后晾干，向銅網(wǎng)上滴加磷鎢酸染色液10 μL，避光染色5 min；用濾紙吸去多余液體，晾干后透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

6 外泌體示蹤

當巨噬細胞RAW264.7達到80%的匯合時，將提取的外泌體用DiI染色后按30 μL/孔轉(zhuǎn)移到RAW264.7細胞6孔板中。按照制造商的說明對細胞進行清洗固定，加入Alexa Fluor標記鬼筆環(huán)肽工作液染色后清洗細胞，于熒光顯微鏡下進行熒光觀察，選擇Alexa FlourTM488發(fā)射濾片?？瞻捉M細胞不進行任何處理。

7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

按照Trizol法從巨噬細胞RAW264.7中提取總RNA，用分光光度計檢測RNA純度與濃度。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑說明書及預實驗確定的反應(yīng)時間與溫度進行RT-PCR。在94 ℃ 5 min預變性后，進行40個周期：94 ℃變性30 s, 94℃復性5 s，60 ℃伸展30 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2‐??Ct方法分析待測基因的 mRNA相對表達水平，至少重復3次。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

8 Western blot

應(yīng)用外泌體RNA/蛋白提取試劑盒按說明書方法提取外泌體中總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白濃度。將等量蛋白質(zhì)樣品通過10% SDSPAGE凝膠電泳進行蛋白分離并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，然后用含5%的脫脂奶粉的PBS封閉液于室溫下封閉2 h后，分別加入抗Alix（1∶1000）、CD63（1∶1000）、TSG101（1∶1000）一抗，在4 ℃搖床孵育過夜。 TBST溶液洗滌3次（10 min/次），HRP標記的二抗（1∶10000）室溫孵育2 h后用TBST溶液洗滌3次（10 min/次）。ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，通過Western blot 成像分析儀（BIO RAD，美國）進行成像。

9 統(tǒng)計學分析

采用 Graphpad prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組樣本時采用單因素方差分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1骨髓間充質(zhì)干細胞與巨噬細胞的形態(tài)學特征

熒光顯微鏡觀察顯示，培養(yǎng)3～5 d后，CP-M131骨髓間充質(zhì)干細胞呈不規(guī)則的長梭形，RAW264.7巨噬細胞呈圓形；F-actin在CP-M131細胞胞質(zhì)內(nèi)呈平行排列成纖維束，在RAW264.7細胞胞質(zhì)內(nèi)呈點塊狀濃聚（圖1）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞及巨噬細胞形態(tài)特征和F-actin分布的免疫熒光檢測。比例尺, 50 μmFig.1 Immunofluorescence examination of morphology of and F‐actin distribution in bone marrow mesenchymal stem cells and macrophage. Scale bar,50 μm

2 骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體超微結(jié)構(gòu)特點與特征蛋白表達

對應(yīng)用聚合物沉淀法提取的CP-M131細胞外泌體進行透射電鏡觀察顯示，外泌體呈圓形或橢圓形，大小不均勻，直徑約 200 nm，有完整的膜結(jié)構(gòu)(圖2A、B)。 Western blot檢測顯示外泌體表達特異性蛋白CD63、TSG101、Alix（圖2C）。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體的透射電鏡檢測鑒定與外泌體特異性蛋白表達檢測。A，外泌體形態(tài)透射電鏡檢測；Lower比例尺，500 nm，Higher比例尺，200 nm。B， 外泌體中TSG101、CD63和Alix表達的Western blot檢測Fig. 2 Transmission electron microscopic identification of the bone marrow mesenchymal stem cell‐ derived exosomes and Western blot detection of expression of exosome specific proteins. A, transmission electron microscopic examination of morphology of the exosomes; scale bar in Lower, 500 nm; scale bar in Higher, 200 nm. B, Western blot detection of expression of TSG101, CD63 and Alix in the exosomes

3 骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體被巨噬細胞內(nèi)吞

將用Dil染色后的不同濃度（0 μg/mL、30μg/mL、60 μg/mL、90 μg/mL）CP-M131細胞外泌體與RAW264.7細胞共培養(yǎng)后，檢測RAW264.7細胞對外泌體的內(nèi)吞作用顯示，外泌體被RAW264.7細胞內(nèi)吞，外泌體濃度在60 μg/mL時，RAW264.7細胞對外泌體的內(nèi)吞作用最明顯（圖3）。

圖3 不同濃度骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體對巨噬細胞吞噬外泌體作用的影響。F-actin染色陽性（綠色）的RAW264.7細胞胞質(zhì)內(nèi)可以看到多少不等的內(nèi)吞的外泌體（紅色）。比例尺，50 μmFig. 3 Effect of different concentrations of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes on phagocytosis of exosomes by macrophages. Different numbers of endocytic exosomes (red) seen in the cytoplasm of RAW264.7 cells with positive F-actin staining (green).Scale bar, 50 μm

4 骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體誘導巨噬細胞向M1型極化

應(yīng)用RT-qPCR方法檢測M1型巨噬細胞特異基因IL-6和iNOS與M2型巨噬細胞特異基因Arg-1和CD206的表達水平顯示（圖4）：以不同濃度骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體與RAW264.7細胞共培養(yǎng)后，iNOS與IL-6的mRNA水平顯著增加，以在外泌體濃度為60 μg/mL時增加最明顯；Arg-1 mRNA表達在外泌體濃度為30 μg/mL與90 μg/mL時增加，但在外泌體濃度為60 μg/mL時降低；CD206 mRNA表達在各種濃度外泌體下均降低。

圖4 不同濃度骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體對M1、M2型巨噬細胞特異基因表達水平影響的RT-qPCR檢測。 與對照組比較：*P＜0.05 ，**P＜0.01Fig. 4 RT‐qPCR examination for the effect of different concentrations of bone marrow mesenchymal stem cell‐derived exosomes on specific gene expression of M1 and M2 macrophages. *P＜0.05, **P＜0.01, compared with control

討 論

隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，由各類原因引發(fā)的骨折相關(guān)疾病日益增長。骨髓間充質(zhì)干細胞作為組織工程研究中最具多向分化潛能的種子細胞，近年來備受關(guān)注，成為研究熱點。機體發(fā)生各種炎癥反應(yīng)的根本環(huán)節(jié)是巨噬細胞的激活與損傷，骨折微環(huán)境細胞中巨噬細胞起主要作用，巨噬細胞的極化參與其進展，同時又受其調(diào)控[23]。巨噬細胞在參與不同炎癥的過程中，分化為具有不同生物學特征的表型。其中M1型巨噬細胞擔任經(jīng)典活化，可通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子、參與正向免疫應(yīng)答、發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；而M2型巨噬細胞擔任替代活化，與免疫抑制和組織修復有關(guān)，通過分泌抑制性細胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[24,25]。部分研究表明，骨折微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細胞與巨噬細胞極化密切相關(guān)。通過表型可鑒定巨噬細胞的類型，研究巨噬細胞在不同生理和病理條件下所發(fā)揮的功能具有重要的意義[26,27]。外泌體是由活細胞分泌的直徑約為30～150 nm的小囊泡，有通訊作用，攜帶有多種蛋白質(zhì)、RNA等重要信息，可通過傳遞miRNA、脂質(zhì)、蛋白等多種活性分子實現(xiàn)細胞間信息傳遞。經(jīng)研究證實，骨髓間充質(zhì)干細胞是通過旁分泌多種可溶性細胞因子而發(fā)揮免疫抑制作用，外泌體是干細胞最重要的旁分泌因子之一[28-30]。在本研究中，我們探索了骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體對巨噬細胞極化的作用，結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體前期調(diào)控巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化。

骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體不僅有干細胞特有修復功能，而且化學性質(zhì)穩(wěn)定，能有效避免細胞治療引起的免疫排斥，具有廣闊的應(yīng)用前景[31,32]。但關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞是否通過外泌體影響巨噬細胞表型仍缺乏報道。本研究首先培養(yǎng)了骨髓間充質(zhì)干細胞與巨噬細胞，并在熒光顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察。其次，從骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中分離得到了外泌體，并通過掃描電鏡、Western blot對外泌體進行鑒定。最后，觀察與不同濃度骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體對巨噬細胞攝取外泌體效率的影響及巨噬細胞極化相關(guān)基因IL-6、iNOS、Arg-1、CD206表達的變化。 IL-6、iNOS是巨噬細胞向M1 型極化緊密相關(guān)的特異標志物；而Arg-1、 CD206 是廣泛使用的M2型巨噬細胞特異標志物。實驗結(jié)果表明：骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體處理使M1型巨噬細胞基因表達量增加， M2型巨噬細胞基因表達量總體降低。但是60 μg/mL的外泌體使M2型巨噬細胞特異基因Arg-1表達顯著升高。因外泌體內(nèi)包含不同的miRNA，有不同的調(diào)控作用。在我們的實驗過程中，提取的外泌體內(nèi)包含調(diào)控巨噬細胞由M2型極化的miRNA，因此在60 μg/ml的濃度下Arg-1表達升高。我們觀察到 iNOS與IL-6表達顯著增加而Arg-1、 CD206 表達減少，表明骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可以誘導 M1 型巨噬細胞極化并抑制 M2 型巨噬細胞極化。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可以調(diào)控巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，并且抑制M2型巨噬細胞活性。本研究結(jié)果肯定了骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體在調(diào)控巨噬細胞極化過程中的重要作用，為臨床治療骨折后炎癥相關(guān)疾病提供了良好的基礎(chǔ)，同時為巨噬細胞的表型鑒定方法提供了新的思路，具有一定的理論指導意義。