林蓉，鄭智文，阮丹丹，曾貞，林欣，胡建民，黃焱*

(福建醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)與工程學院眼視光學系，福州 350004)

如今，發(fā)光二極管（light-emitting diodes, LEDs）作為一種節(jié)能光源，正在逐步取代傳統(tǒng)光源，成為國內(nèi)光源的主流，廣泛應用于智能手機、數(shù)字顯示器和計算機屏幕等電子消費產(chǎn)品中。LEDs所發(fā)出的400~495 nm的短波長藍光具有相對較高的能量，能夠穿透角膜和晶狀體到達視網(wǎng)膜，造成嚴重的視網(wǎng)膜損傷[1]。視網(wǎng)膜光感受器及色素上皮層代謝活躍，又處于富氧環(huán)境中，給予一定的光子刺激便可在視網(wǎng)膜外層發(fā)生光化學損傷反應，破壞線粒體內(nèi)氧化平衡，觸發(fā)線粒體相關(guān)的凋亡信號通路，最終導致過量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）積聚，氧化應激甚至是細胞凋亡壞死[2]。

氧化應激（oxidative stress, OS）改變細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)細胞反應，這取決于暴露的類型和嚴重程度。從本質(zhì)上講，氧化應激存在一個極限壓力閾值：在該閾值以下，細胞會觸發(fā)其保護機制；相反，如果壓力超過閾值或保護機制的激活失敗，會觸發(fā)細胞其他信號通路，最終導致細胞凋亡、壞死[3]。研究證明，視網(wǎng)膜光損傷可能與氧化應激損傷相關(guān)[4,5]，流行病學調(diào)查也揭示了其與視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa, RP)和老年性黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD）的發(fā)病機制密切相關(guān)，后者是視力永久性喪失的主要原因，在老年人中非常常見[6,7]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2, Nrf2）是重要的內(nèi)源性抗氧化通路，可調(diào)節(jié)下游因子血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1），中和自由基，防止和修復ROS造成的損害，從而增強免疫防御，降低患某些疾病的風險，從而發(fā)揮抗氧化作用[2,4]?；谏鲜隼碚?，本實驗選用短波藍光光源作為氧化應激源，設置同一波長強度、不同照射時長的藍光實驗組，觀察藍光損傷大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1蛋白表達變化，從而進一步探討藍光損傷視網(wǎng)膜的機制。

材料和方法

1 實驗動物

40只7周齡清潔級雄性SD雄性大鼠購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心 [許可證號：SCXK（閩）2016-0002]，體重200~250 g，于通氣、通風良好的動物房中給與正常飲食、飲水，適應性飼養(yǎng)一周。本實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批。

2 主要儀器與試劑

自制570 mm×490 mm×625 mm藍光照射箱；TL-D18W/52藍光燈管（波長：400～500 nm，峰值450 nm）；數(shù)字光照度計（深圳聚茂源科技有限公司）；酶標儀（Labsystems Multiskan MS 公司，芬蘭）；洗板機（Thermo Labsystems公司，芬蘭）；脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；顯微鏡（Nikon，E100）。FAS眼球固定液（Servicebio，貨號：G1109-100ML）；蘇木素染色液（Servicebio，貨號：G1004）；環(huán)保型脫蠟液（武漢賽維爾生物，貨號：G1128）；蛋白酶K（Servicebio，貨號：G1205）；破膜液（Servicebio，貨號：G1204）；DAPI（Servicebio，貨號：G1012）；抗熒光淬滅封片劑（Servicebio，貨號：G1401）；TUNEL試劑盒試劑盒（Servicebio，貨號：G1501）；3%過氧化氫（Servicebio，貨號：G0115）；免疫組織化學試劑盒DAB顯色劑（Servicebio，貨號：G1211）；EDTA（pH8.0）抗原修復液（Servicebio，貨號：G1206）；EDTA（pH9.0）抗原修復液（Servicebio，貨號：G1203）；檸檬酸（pH6.0）抗原修復液（Servicebio，貨號：G1202）；兔抗大鼠Nrf2抗體（Servicebio，貨號：GB11549）；兔抗大鼠HO-1抗體（Servicebio，貨號：AF7066）；HRP標記的山羊抗兔IgG（Servicebio，貨號：GB23303）；正常兔血清封閉液（Servicebio，貨號：G1209）；PBS（Servicebio，貨號：G0002）；蘇木素染色液（Servicebio，貨號：G1004）；眼球固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

3 自制藍光照射箱

根據(jù)劉維烊等[8]對大鼠的照射方法進行改良，自制藍光照射箱。鐵絲網(wǎng)制成底面（600 mm×500 mm），并在其上固定6個等距長方體鐵絲籠（170 mm×80 mm×90 mm），頂蓋可拆卸。另制作無底紙箱（570 mm×490 mm×625 mm），以鐵絲網(wǎng)格為底，于箱子頂部安裝3根藍光燈管，使每個網(wǎng)籠內(nèi)數(shù)字式光照強度計測得的藍光強度約為2500 Lux。藍光從大鼠頭部的前上方照射，以盡量減少眼瞼的遮蓋。

4 分組及干預方法

按照隨機數(shù)字表法將40只健康SD大鼠隨機分為對照（Control）組、實驗A（ExpA）組、實驗B（ExpB）組、實驗C（ExpC）組，每組10只。對照組正常飼養(yǎng)，不予以藍光照射；實驗組每天接受2500 Lux的藍光（峰值450 nm）照射12 h，分別照射10 d（ExpA組）、20 d（ExpB組）、30 d（ExpC組），照射時間于當日19:00至次日的7:00共12 h。37 d后處死取材。

5 HE染色

新鮮大鼠眼組織用FAS眼球固定液固定24 h后，放于脫水盒內(nèi)脫水、浸蠟，將浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋。將冷卻后的蠟塊置于石蠟切片機切片，切片厚度約為4 μm。然后進行蘇HE 染色，光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)變化。

6 TUNEL法檢測視網(wǎng)膜組織凋亡指數(shù)

切片常規(guī)脫蠟、水化后滴加蛋白酶K工作液于37 °C恒溫箱孵育22 min，洗滌待切片稍干后滴加破膜工作液覆蓋組織常溫孵育20 min，室溫平衡后取TUNEL試劑盒內(nèi)TdT酶、FITC-dUTP、緩沖液按照1:5:50比例混合，覆蓋組織于37 °C恒溫箱孵育2 h，DAPI復染細胞核后使用抗熒光淬滅封片劑進行封片，切片于熒光顯微鏡下觀察（FITC激發(fā)波長465~495 nm，發(fā)射波長515~555 nm；DAPI紫外激發(fā)波長330~380 nm，發(fā)射波長420 nm）并采集圖像。視網(wǎng)膜組織凋亡結(jié)果判斷：每張切片隨機取5個200倍視野，計數(shù)TUNEL染色陽性（凋亡）細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

7 免疫組織化學染色法檢測視網(wǎng)膜組織Nrf2和HO-1表達

將視網(wǎng)膜標本脫蠟、水化后置于EDTA抗原修復緩沖液（pH9.0）中，于微波爐內(nèi)進行抗原修復，3%過氧化氫溶液室溫孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加3%BSA均勻覆蓋組織后室溫封閉30 min，加入兔抗大鼠Nrf2抗體（1:100）或兔抗大鼠HO-1抗體（1:500）于濕盒內(nèi)4 °C孵育過夜，第2 d滴加HRP標記的山羊抗兔IgG（1:200）室溫孵育50 min，隨后DAB顯色液孵育，顯微鏡下控制顯色時間，自來水沖洗切片終止染色，蘇木素復染細胞核，脫水封片后于顯微鏡下觀察。判斷標準為免疫組化反應后陽性標記的細胞胞漿著色呈棕色或深棕色。隨機選取5個200倍視野，使用Image J軟件分析、測定光密度值（optical density，OD）值，以代表Nrf2和HO-1免疫反應性。

8 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件，各觀察數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用Graphpad prism 9.3.0作圖，以雙側(cè)P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 藍光暴露使視網(wǎng)膜厚度下降

HE染色顯示（圖1）：對照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊；實驗A組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，個別細胞輕度水腫；實驗B組大鼠視網(wǎng)膜組織排列基本整齊，外核層（outer nuclear layer, ONL）厚度顯著降低；實驗C組大鼠視網(wǎng)膜組織排列基本整齊，視網(wǎng)膜厚度、感光細胞層（photoreceptor cell layer, PCL）厚度和ONL厚度均下降。

圖1 HE染色檢測藍光暴露對視網(wǎng)膜組織學影響。A，各組視網(wǎng)膜代表性HE染色結(jié)果；GCL，節(jié)細胞層；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；PCL，感光細胞層；比例尺，40 μm。B，視網(wǎng)膜厚度、ONL厚度、PCL厚度的定量分析；與Control組比較：*P<0.05；與ExpA組比較：#P<0.05；與ExpB組比較：$P<0.05Fig.1 HE staining of the effects of blue light exposure on retinal histology. A, representative HE staining results of the retinal tissue of each group; GCL,ganglion cell layer; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; PCL, photoreceptor cell layer; scale bar, 40 μm. B, quantitative analysis of the thickness of the retina, ONL and PCL; *P<0.05, compared with Control group; #P<0.05, compared with ExpA group; $P<0.05, compared with ExpB group

2 藍光暴露誘導視網(wǎng)膜組織細胞凋亡

TUNEL染色顯示：對照組和實驗A組視網(wǎng)膜內(nèi)未見凋亡細胞；實驗B組視網(wǎng)膜內(nèi)較多凋亡細胞，實驗C組視網(wǎng)膜內(nèi)可見大量凋亡細胞，凋亡細胞主要存在于ONL層。取實驗B組和C組各5個視野計算視網(wǎng)膜凋亡指數(shù)，分別為（20.724±0.824）%和（40.607±0.896）%。

3藍光暴露上調(diào)視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1表達

免疫組織化學染色顯示：與對照組相比，各實驗組的Nrf2免疫反應性均顯著增強，且隨著照射時間的增加而逐漸增強；實驗B組的HO-1免疫反應性顯著增強，實驗A組和C組有增強趨勢，但不具有統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 藍光暴露對視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1表達影響的免疫組織化學檢測。A，視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1免疫組織化學染色；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；GCL，節(jié)細胞層；比例尺，40 μm。B，Nrf2免疫反應性的統(tǒng)計學分析； C，HO-1免疫反應性的統(tǒng)計學分析；與Control組比較：*P<0.05；與ExpA組比較：#P<0.05；與ExpB組比較：$P<0.05Fig. 3 Immunohistochemical detection of the effect of blue light exposure on the expression of Nrf2 and HO‐1 in the retinal tissue. A, immunohistochemical staining of Nrf2 and HO-1 in the retina; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer; scale bar, 40 μm. B,statistical analysis of Nrf2 immunoreactivity; C, statistical analysis of HO-1 immunoreacxtivity; *P<0.05, compared with Control group; #P<0.05,compared with ExpA group; $P<0.05, compared with ExpB group

討 論

早在1966年就有人提出，長時間暴露于低強度的短波長光下會導致視網(wǎng)膜損傷，其中波長范圍在415~455 nm的藍光屬于有害藍光[9,10]，這一范圍的短波藍光又可稱為短波高能藍光，可透過晶狀體直達視網(wǎng)膜，觸發(fā)或加重黃斑和視網(wǎng)膜光化學損傷。眼睛吸收光線的主要部位是視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）和視錐、視桿細胞[11]，因此 LEDs誘導的視網(wǎng)膜損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮細胞和視錐、視桿細胞[11-13]。視錐細胞和視桿細胞也稱為光感受器細胞，作為視網(wǎng)膜主要的感光細胞，具有較高的能量需求和代謝活性，其主要功能是通過視網(wǎng)膜內(nèi)的感光色素向大腦傳輸視覺色素刺激[14]。藍光的光毒性可能與老年性黃斑變性和視力喪失的進展和嚴重程度有關(guān)[1]，過度暴露于藍光下會導致視網(wǎng)膜組織內(nèi)ROS顯著增加，光感受器喪失、脂質(zhì)過氧化和細胞凋亡[15]。在一項藍光對小鼠視網(wǎng)膜光化學損傷的實驗中發(fā)現(xiàn)，藍光LED暴露3 d后，眼底檢查發(fā)現(xiàn)白斑，組織學檢查顯示光感受器內(nèi)短和外段連接處有大量物質(zhì)堆積[16]。不僅如此，Lin[17]等人證實藍光暴露可刺激視錐、視桿細胞啟動氧化機制，產(chǎn)生大量自由基，破壞機體正常氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡，引起線粒體功能障礙和干擾蛋白質(zhì)的正確折疊，最終引起細胞死亡。本研究借鑒Lin[17]，F(xiàn)eng[18]，Moon[19]等團隊的經(jīng)驗，實驗組選定波長峰值450 nm的藍光燈管，照射強度為2500 lux，每日照射時間定為12 h，分別照射10 d、20 d、30 d，成功復制光損傷大鼠視網(wǎng)膜模型。實驗結(jié)果顯示，藍光暴露10 d后大鼠視網(wǎng)膜ONL層厚度下降，細胞凋亡指數(shù)隨時間增加而增加，證實了藍光暴露主要損傷部位為視錐、視桿細胞[20]。有研究認為是先損傷視桿細胞繼而損傷視錐細胞[21]，但從本文中無法證實，還需進一步的研究。

圖2 藍光暴露對視網(wǎng)膜組織細胞凋亡影響的TUNEL法檢測。比例尺，40μm；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；GCL，節(jié)細胞層Fig. 2 Detection by TUNEL staining of effect of blue light exposure on apoptosis in retinal tissue. Scale bar, 40 μm; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer

氧化應激與腎病[21]、血管功能障礙[22]和糖尿病視網(wǎng)膜病變[23]的發(fā)病機制均有關(guān)，此前也有報道稱氧化應激與光誘導的視網(wǎng)膜損傷之間存在很強的相關(guān)性。過量ROS破壞細胞穩(wěn)態(tài)，引起DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的過氧化，導致氧化應激和組織損傷[17]。Nrf2通路是保護細胞免受氧化應激的最重要途徑之一，在沒有受到外界氧化應激的情況下，Nrf2處于非活性狀態(tài)，存在于細胞質(zhì)中[25]。當細胞暴露在氧化壓力下時，Nrf2從Keap1中釋放出來，并移動到細胞核，與位于核內(nèi)的ARE結(jié)合，繼而調(diào)控下游II相解毒酶、抗氧化物酶及抗炎癥蛋白等表達，如醌氧化還原酶1（NAD（P）H:quinone oxidoreductase l, NQO1)、環(huán)氧化物水解酶、乙醛還原酶、血紅素加氧酶 1 (Heine oxygenase-1, HO-1)、γ‐谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ‐glutamyl cysteinesynthetase, γ‐GCS)，從而發(fā)揮其抗氧化作用。HO-1蛋白聯(lián)合NADPH及細胞色素P450，通過膽綠素還原酶(biliverdin reductase,BVR)降解血紅素并生成膽綠素、CO和Fe2+，構(gòu)成內(nèi)源性保護物質(zhì)來調(diào)節(jié)細胞氧化、凋亡等多種細胞的生化活動[26]。Yang[27]等發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以激活Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增加HO-1基因的表達和谷胱甘肽（glutathione, GSH）的產(chǎn)生，從而減輕藍光暴露引起的氧化應激反應，而使用Nrf2抑制劑則阻斷蘿卜硫素的保護作用，證實了蘿卜硫素是通過激活Nrf2通路起到保護作用。本研究中發(fā)現(xiàn)在Nrf2隨著照射時長的增加而增多，而其下游因子HO-1含量升高，但與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義，并未隨著Nrf2的增加而增加。我們推測在強度恒定的情況下，藍光照射要累積達到一定的照射量才會引起視網(wǎng)膜氧化應激反應，造成細胞凋亡，其中損傷主要發(fā)生在光感受器細胞層，且損傷程度與照射時長成正比，即隨著照射時間的增加，細胞凋亡的數(shù)量增多。在這一過程中，視網(wǎng)膜組織內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS促進Nrf2活化，使其進入細胞核，發(fā)揮其抗氧化損傷作用從而減少視網(wǎng)膜損傷，但若暴露時間過長，可能導致Nrf2/HO-1通路失效，激活其他信號通路造成損傷，其具體機制還需進一步的實驗加以證明。

盡管本研究已經(jīng)證實了藍光暴露破壞視網(wǎng)膜組織內(nèi)氧化還原的動態(tài)平衡，導致視網(wǎng)膜視錐、視桿細胞損傷、凋亡，激活Nrf2通路以清除自由基，但下游因子HO-1的變化與他人研究不一致，下一步將測量Nrf2通路其他下游蛋白加以證明光化學損傷時是通過何下游蛋白發(fā)揮作用。另外本研究的數(shù)據(jù)皆為半定量，本課題組將以此為基礎，構(gòu)建661W細胞光化學損傷模型和大鼠視網(wǎng)膜光化學損傷模型，定性測量細胞和視網(wǎng)膜組織內(nèi)氧化指標，如8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OhdG）、硝基酪氨酸、丙烯醛，ROS含量以及Nrf2通路相關(guān)因子來確定藍光暴露損傷視網(wǎng)膜的具體機制。

綜上所述，長時間暴露于短波藍光中使大鼠視網(wǎng)膜厚度下降，ONL厚度下降，主要誘導視錐、視桿細胞凋亡，激活視網(wǎng)膜組織氧化應激反應，使Nrf2、HO-1表達增加，從而發(fā)揮抗氧化作用以減輕視網(wǎng)膜損傷。