劉 興,高 波,吉紅九,賈超峰,祝 斐,孟 乾,陳淑吟,張志勇,徐士霞

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇省生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023) (2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇省海水魚類遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南通 226007)

鱸形目(Perciformes)是魚類中物種豐富度最高的一個(gè)目,包括25個(gè)亞目、160科、1 539屬、10 033種[1]. 鱸形目物種分布廣泛,大多生活在海洋,僅有少數(shù)(如鱸科、麗鯛科等)生活在淡水水域[1]. 鱸形目多個(gè)物種是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類,具有重要食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值. 據(jù)報(bào)道高密度養(yǎng)殖模式會(huì)引起鱸形目物種病害頻繁發(fā)生,尤其是受到多種細(xì)菌、病毒等病原微生物威脅[2]. 魚類病害的爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降,從而造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失. 因此,研究鱸形目免疫基因的進(jìn)化不僅有助于理解宿主和病原體間的作用機(jī)制,也為物種遺傳育種及疾病防治提供重要的參考依據(jù).

先天性免疫在抵抗外界病原體入侵方面起著重要作用,是動(dòng)物的主要防御機(jī)制,代表著抵御病原體入侵的第一道防線,在維持生物體生長、發(fā)育和生存過程中發(fā)揮最重要作用[3-4]. 魚類屬于變溫動(dòng)物,其淋巴細(xì)胞增殖緩慢導(dǎo)致適應(yīng)性免疫相對(duì)滯后且免疫應(yīng)答能效較低,因此魚類先天性免疫在抵御病原體感染的過程中扮演更為重要的角色[5]. 研究表明,先天性免疫系統(tǒng)主要通過免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)并結(jié)合病原體中存在的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),包括微生物的CpG ODN、脂蛋白、dsRNA等,從而引發(fā)一系列的免疫反應(yīng),以消滅入侵的病原體[6]. 其中,抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)家族是關(guān)鍵的PRR,在誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著重要作用[3]. 根據(jù)不同TLRs識(shí)別不同病原相關(guān)分子模式,魚類TLR通常分為兩類,第一類包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR9,主要參與機(jī)體對(duì)細(xì)菌的識(shí)別,被稱為非病毒型TLRs;第二類包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR22,主要參與病毒的識(shí)別,被稱為病毒型TLRs[7].

到目前為止,魚類中已經(jīng)鑒定出大約23種TLRs[8],典型的TLRs蛋白結(jié)構(gòu)包括亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRRs)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、胞內(nèi)Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR),其中LRRs區(qū)通過與相應(yīng)的配體結(jié)合,使得Toll樣受體被激活,進(jìn)一步通過TIR結(jié)構(gòu)域與接頭分子MyD88(髓樣分化因子)結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子抵御病原菌的入侵,TIR區(qū)相對(duì)保守,與分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[3]. TLRs在魚類免疫中的作用已被廣泛研究,病原體感染后TLRs相關(guān)基因表達(dá)量會(huì)發(fā)生不同的變化來適應(yīng)特定的生存環(huán)境. 大西洋鯛(Sparusaurata)被嗜水氣單胞菌感染后,TLR2表達(dá)發(fā)生上調(diào)[9];大黃魚(Larimichthyscrocea)被嗜水氣單胞菌感染后,TLR1、TLR3表達(dá)上調(diào),TLR2、TLR22表達(dá)下調(diào)[10];海魚分枝桿菌也被證實(shí)可以誘導(dǎo)斑馬魚TLR9表達(dá)上調(diào)[11]. 值得注意的是,TLR9與其他非病毒型TLRs不同,該受體只存在于細(xì)胞內(nèi)部,也是識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中CpG ODN的主要受體,通過與CpG特定的序列結(jié)合最終引起免疫器官的功能性成熟,進(jìn)而產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)細(xì)胞[12],此外,該受體也被認(rèn)為能與其配體協(xié)同進(jìn)化,因此是研究魚類抗病原體免疫適應(yīng)的重要模型. 在非病毒型TLRs中,TLR1似乎也擁有獨(dú)特的抗病原免疫機(jī)制,盡管目前TLR1在大黃魚、綠河豚(Tetraodonnigroviridis)、斑馬魚等物種中鑒定出來,并且病原感染實(shí)驗(yàn)也表明該受體在魚類病原免疫中發(fā)揮著重要作用,但是目前魚類TLR1的配體還未明確,相關(guān)研究表明TLR1可能需要與TLR2形成異源二聚體發(fā)揮作用,因此TLR1仍需要更深入的研究[13-14]. 目前國內(nèi)外對(duì)鱸形目TLRs家族研究大多局限在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中,然而其分子進(jìn)化基礎(chǔ)仍不完全清楚. 本研究以17種鱸形目物種的TLR1、TLR9為候選基因,嘗試通過分析這兩個(gè)基因分子進(jìn)化揭示其先天性免疫機(jī)制. 研究結(jié)果對(duì)于鱸形目魚類的遺傳育種以及疾病防治具有一定的指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 TLR1和TLR9序列獲得與比對(duì)

本研究共選取17種鱸形目物種,涵蓋攀鱸科、鲹科、狼鳚科、鱸科、鮨科、花鱸科、鱷冰魚科、龍科、南極魚科、石首魚科、鯛科,并選取斑馬魚作為外群. 除了真鯛以及黑鯛TLR1基因外,本研究所使用物種的TLR1、TLR9基因序列信息均來自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(表1). 進(jìn)一步,以大西洋鯛TLR1作為參考序列在真鯛(Pagrusmajor)以及黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)基因組中進(jìn)行本地Blast[15]以獲取對(duì)應(yīng)的TLR1基因,E-value值設(shè)定為1e-5,其中真鯛基因組來自NCBI數(shù)據(jù)庫,黑鯛基因組為江蘇省海洋水產(chǎn)研究所與南京師范大學(xué)合作測(cè)序數(shù)據(jù)(未發(fā)表). 使用Prank[16]軟件對(duì)每一個(gè)基因基于密碼子水平進(jìn)行多序列比對(duì),然后使用Gblocks[17]軟件對(duì)序列非保守區(qū)域進(jìn)行比對(duì)和人工校對(duì).

表1 本文研究所選物種基因序列登錄號(hào)Table 1 Accession numbers of species used in this study

1.2 TLR9和TLR1基因樹重建

為探討TLRs在鱸形目物種內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,通過Modelgenerator[18]軟件選擇最佳核苷酸替換模型,使用RAxML[19]軟件構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)生樹,斑馬魚作為外群,自展1 000次估計(jì)節(jié)點(diǎn)的支持度(bootstrap value). 另外,為了使得樹的結(jié)果更加可靠,也使用了Mrbayes[20]軟件基于貝葉斯法進(jìn)行構(gòu)樹,其中后驗(yàn)概率借助馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法(markov chain monte carlo,MCMC)運(yùn)行100000代進(jìn)行估計(jì).

1.3 分子進(jìn)化分析

為了探究TLR1和TLR9在鱸形目中的進(jìn)化模式,本研究使用 PAML4.7(phylogenetic analysis by maximum Likelihood,PAML)軟件[21]中CODEML程序?qū)Ψ峭x替換率(nonsynonymous,dN)和同義替代率(synonymous,dS)的比值(ω=dN/dS)進(jìn)行評(píng)估.ω值為衡量選擇壓力的重要指標(biāo),其中ω<1、=1和>1分別意味著受純化選擇(Purify selection)、中性選擇(Neutral selection)和正選擇(Positive selective). 使用目前公認(rèn)的鱸形目系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[22]以及TimeTree網(wǎng)站(http://www.timetree.org/)的系統(tǒng)發(fā)育樹作為PAML分析的輸入樹(圖1).

圖1 本研究用于PAML分析的輸入樹. Branch-site、Free ratio結(jié)果分別使用圓圈以及三角符號(hào)標(biāo)記Fig.1 The input phylogenetic tree used in PAML analyses in this study. The results of Branch-site and Free ratio models were marked with circles and triangles,respectively

運(yùn)用基于最大似然法的PAML4.7軟件包[21]和Datamonkey[23]進(jìn)行評(píng)估鱸形目物種中TLR1和TLR9兩個(gè)基因座中受正選擇作用的位點(diǎn). 首先,運(yùn)用PAML 軟件包中的位點(diǎn)模型(Site model)中的兩對(duì)模型:M1a(中性模型)vs. M2a(正選擇模型)、 M8a(中性模型,beta 分布:0<ω0<1和ω1=1)vs. M8(正選擇模型;beta分布:0<ω0<1和ω1>1)進(jìn)行檢測(cè). 運(yùn)用似然比檢驗(yàn)(likelihood ratio test,LRT)評(píng)估嵌套模型中的最佳模型,并通過2ΔlnL值與自由度之間的卡方分布(Chi-square test,χ2)關(guān)系檢測(cè)上述兩個(gè)模型的顯著性. 當(dāng)模型通過LRT檢驗(yàn)且P值顯著時(shí),運(yùn)用貝葉斯經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法[24](bayes empirical bayes,BEB)檢測(cè)正選擇位點(diǎn),其中后驗(yàn)概率(posterior probabilities,PP)值大于0.9的位點(diǎn)作為潛在的正選擇位點(diǎn). 另外,基于同義替代的Datamonkey[23]方法進(jìn)一步用于正選擇位點(diǎn)的檢測(cè),運(yùn)用了三種最大似然法,包括固定效應(yīng)似然法(fixed effects likelihood,FEL)、隨機(jī)效應(yīng)似然法(random effects likelihood,REL)、快速無約束貝葉斯估算法(fast unconstrained bayesian approximation,FUBAR). FEL顯著性水平設(shè)置為0.2,REL貝葉斯顯著水平設(shè)置為50,FUBAR中后驗(yàn)概率固定閾值0.8.

為了進(jìn)一步檢測(cè)正選擇是否局限于特定的進(jìn)化譜系,運(yùn)用PAML4.7軟件包中的自由比率模型(Free-ratio model)和支位點(diǎn)模型(Branch-site model)進(jìn)行檢測(cè). 自由比率模型假設(shè)每一支系具有獨(dú)立的ω值,該模型與零假設(shè)——單一比率模型(One-ratio model)即所有支系具有相同的ω值進(jìn)行比較. 支位點(diǎn)模型(Branch-site model)是最嚴(yán)格的選擇壓力檢測(cè)的方法,不僅能夠檢測(cè)受正選擇的支系還能檢測(cè)受正選擇的位點(diǎn). 該模型需要將進(jìn)化譜系分為前景支(foreground branch,即感興趣的支系)與背景支(background branch,即其余的支系). 本研究中,將17種鱸形目物種分別標(biāo)記為前景支,零假設(shè)Ma0(中性模型:0<ω0<1,ω1=1和ω2=1)和備擇假設(shè)Ma(正選擇模型:0<ω0<1,ω1>1和ω2≥1)進(jìn)行比較. 運(yùn)用LRT檢測(cè)嵌套模型的顯著性,P<0.05時(shí)則為模型顯著,且所檢測(cè)的位點(diǎn)PP>0.9時(shí),被認(rèn)為是正選擇位點(diǎn).

1.4 TLR1和TLR9蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過MEGA[22]軟件將TLR1、TLR9完整核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,利用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸的變化可能引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)型的改變,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能. 為了進(jìn)一步為探究正選擇位點(diǎn)在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上的空間分布,本研究使用I-TASSER(Iterative Threading ASSEmbly Refinement)網(wǎng)站對(duì)黑鯛TLR1和TLR9蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并通過EZMOL(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ezmol/)網(wǎng)站定位正選擇位點(diǎn)在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上的位置,從而更直觀地分析位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為了探討鱸形目TLRs的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,首先,基于Modelgenerator[19]軟件分析,發(fā)現(xiàn) GTR+GAMMA+I模型為核苷酸替代的最佳模型. 其次,使用RAxML軟件構(gòu)建基因最大似然樹(圖2). 基因樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示鱸形目TLRs的基因根據(jù)TLR1和TLR9兩個(gè)基因座聚成了兩個(gè)基因簇. 但是,基因樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與物種樹存在差異,在TLR1物種樹中,日本真鱸(Lateolabraxjaponicus)與鮸魚(Miichthysmiiuy)聚在一起,而在基因樹中,鮸魚與鯛科的大西洋鯛拓?fù)潢P(guān)系最近. 在TLR9基因樹中,除了兩個(gè)鮨科物種斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)以及鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)沒有與黃鱸(Percaflavescens)聚在一起,基因樹與物種樹其他物種親緣關(guān)系基本一致. 同時(shí),貝葉斯樹也同樣支持了最大似然法構(gòu)建的基因樹,兩種方法得到的物種基因樹在整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上基本一致(圖3). 綜上,基因樹與物種樹的拓?fù)洳町惐砻髟隰~類進(jìn)化過程中,TLR1、TLR9基因已經(jīng)發(fā)生了獨(dú)特的進(jìn)化,以適應(yīng)不同生境下病原微生物的侵染.

紅色和藍(lán)色三角形、五角星分別代表鱸形目TLR1以及TLR9支系. 節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示支持度大于50%圖2 最大似然法構(gòu)建鱸形目TLR1、TLR9系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Reconstruction of the TLR1 and TLR9 phylogenetic tree of Perciformes by the maximum likelihood method

紅色和藍(lán)色五角星三角形、五角星分別代表鱸形目TLR1以及TLR9支系. 節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示后驗(yàn)概率圖3 貝葉斯法構(gòu)建鱸形目TLR1、TLR9系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Reconstruction of the TLR1 and TLR9 phylogenetic tree of Perciformes by Bayesian method

2.2 選擇壓力分析

為了檢測(cè)TLR1和TLR9兩個(gè)基因座在鱸形目物種中是否存在正選擇位點(diǎn),首先運(yùn)用PAML4.7軟件中位點(diǎn)模型(M1a vs. M2a、M8a vs. M8)進(jìn)行檢測(cè). LRT結(jié)果顯示正選擇模型M2a和M8均顯著優(yōu)于中性模型M1a和M8a. 在TLR1基因座位中,正選擇模型M2a、M8中ω值分別為2.55和2.05,提示TLR1受正選擇,并且M2a,M8通過BEB方法分別檢測(cè)到3個(gè)、47個(gè)正選擇位點(diǎn)的后驗(yàn)概率大于0.9,在TLR9檢測(cè)結(jié)果中,M2a、M8模型分別檢測(cè)到3、30個(gè)正選擇位點(diǎn). 當(dāng)后驗(yàn)概率提高到0.95時(shí),在TLR1檢測(cè)結(jié)果中,M2a,M8分別篩選到1個(gè)、20個(gè)正選擇位點(diǎn),而在TLR9中,M2a模型未檢測(cè)到后驗(yàn)概率大于0.95的位點(diǎn),M8模型則檢測(cè)到10個(gè)正選擇位點(diǎn). 另外,采用DataMonkey網(wǎng)站中的三種最大似然法(FEL、REL以及FUBAR)進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)基因座位進(jìn)行選擇壓力檢測(cè). 結(jié)果表明,運(yùn)用三種方法在TLR1基因座位(FEL:28,REL:8,FUBAR:13)以及TLR9基因座位(FEL:24,REL:6,FUBAR:3)共檢測(cè)53個(gè)正選擇位點(diǎn). 綜合以上五種最大似然法,TLR1與TLR9中被兩種以上方法同時(shí)檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)分別為16和8個(gè),提示這些位點(diǎn)為強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn),同時(shí)被三種以上方法檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)分別為7個(gè)和3個(gè)(表2).

表2 PAML和Datamonkey檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)Table 2 Sites under positive selection detected by PAML and Datamonkey

運(yùn)用單一比率模型(One-ratio model)假設(shè)所有支系具有相同的進(jìn)化速率,結(jié)果顯示鱸形目物種TLR1和TLR9的ω值分別為0.38與0.36,顯著小于1,提示這兩個(gè)基因整體受到強(qiáng)烈的選擇約束. 為了進(jìn)一步探究正選擇是否局限于鱸形目特異的支系,運(yùn)用自由比率模型(Free-ratio model)進(jìn)行檢測(cè). LRT結(jié)果顯示嵌套模型(One ratio vs. Free ratio)差異顯著(P<0.01),說明自由比率模型顯著優(yōu)于單一比率模型. Free-ratio模型發(fā)現(xiàn)TLR1在日本真鱸顯著受正選擇;而TLR9基因座位中則檢測(cè)到多個(gè)正選擇支系,例如黃鱸與白梭吻鱸(Sanderlucioperca)最近共同祖先支,日本真鱸、鮸魚、真鯛、大西洋鯛以及黑鯛的最近共同祖先支(圖2、表3). Free ratio模型檢測(cè)到一些支系中存在正選擇信號(hào)(ω>1),據(jù)報(bào)道這些支系長期受到病原微生物的侵襲,比如鯛科支系已被報(bào)道經(jīng)常受到虹彩病毒侵襲,引起組織細(xì)胞腫大壞死[25].

運(yùn)用最嚴(yán)格的支位點(diǎn)模型(Branch-site model)檢測(cè)選擇壓力,結(jié)果提示在TLR1基因座位中,正選擇分別發(fā)生在龜殼攀鱸(Anabastestudineus)、鮸魚、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)、伯氏肩孔南極魚(Trematomusbernacchii)以及南喬治亞擬冰魚(Pseudochaenichthysgeorgianus)、尖頭裸龍(Gymnodracoacuticeps)最近共同祖先支,斜帶石斑魚和鞍帶石斑魚最近共同祖先支,真鯛、黑鯛及大西洋鯛最近共同祖先支;在TLR9中,黃鱸、白梭吻鱸以及橙胸鏢鱸(Etheostomaspectabile)最近共同祖先支,真鯛、黑鯛及大西洋鯛最近共同祖先支也分別檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)(表4).

表3 基因位點(diǎn)模型和分支模型檢測(cè)結(jié)果Table 3 The result for site model and branch model(PAML)tests of genes

表4 TLR1和TLR9基因支位點(diǎn)模型檢測(cè)結(jié)果Table 4 The result for Branch-site model test of genes

續(xù)表4 Table 4 continued

2.3 TLR1、TLR9結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及正選擇位點(diǎn)標(biāo)注在三維結(jié)構(gòu)中

本研究選取了親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大西洋鯛(鯛科)、伯氏肩孔南極魚(南極魚科)、龜殼攀鱸(攀鱸科)三個(gè)物種為代表進(jìn)行氨基酸序列分析. 利用SMART網(wǎng)站分別預(yù)測(cè)TLR1、TLR9蛋白結(jié)構(gòu)域并通過IBS[26]軟件對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化(圖4). 龜殼攀鱸、大西洋鯛、伯氏肩孔南極魚三個(gè)物種中,TLR1編碼序列長度相似,分別為798、802、802個(gè)氨基酸,其中大西洋鯛具有最多的亮氨酸重復(fù)區(qū)(13個(gè)),但值得注意的是,此物種未檢測(cè)到羧基端亮氨酸重復(fù)區(qū);伯氏肩孔南極魚亮氨酸重復(fù)區(qū)數(shù)量最少(4個(gè))并且未檢測(cè)到跨膜區(qū). TLR9在三個(gè)物種中相對(duì)更為保守,都含有典型的TLRs蛋白結(jié)構(gòu)域(LRR、TM、TIR),其中亮氨酸重復(fù)區(qū)數(shù)量分別為12、13、15個(gè). 為了進(jìn)一步探究正選擇位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響,將這些位點(diǎn)標(biāo)注在蛋白三維結(jié)構(gòu)中,首先利用I-TASSER網(wǎng)站預(yù)測(cè)了黑鯛蛋白三維結(jié)構(gòu)模型并通過EZMOL在線網(wǎng)站將同時(shí)被兩種最大似然法鑒定到的正選擇位點(diǎn)(TLR1:16和TLR9:8)標(biāo)注到三維模型中(圖5),發(fā)現(xiàn)58%的正選擇位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)重要功能域,且86%強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn)位于病原體識(shí)別區(qū)域亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRRs).

SP:信號(hào)肽;LRR:亮氨酸重復(fù)區(qū);TM:跨膜區(qū);LRRCT:羧基端亮氨酸重復(fù)區(qū);TIR:Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域.圖4 不同物種TLR1、TLR9蛋白結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparison of the TLR1、TLR9 domain structures among various species

圖5 基因正選擇位點(diǎn)在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的標(biāo)注Fig.5 Annotation of the positive selection sites of genes in the three-dimensional structure of the protein

3 結(jié)論

TLRs是進(jìn)化保守的蛋白質(zhì),傳統(tǒng)上受到強(qiáng)烈的功能約束. 然而,最近的研究已經(jīng)在一些脊椎動(dòng)物群體中發(fā)現(xiàn)正選擇的證據(jù),如鳥類中TLR3、4、5和15基因、嚙齒動(dòng)物的TLR4基因等[27-29]. 相對(duì)于恒溫哺乳類、鳥類物種,生活在水體中的魚類因沒有自我調(diào)節(jié)體溫的機(jī)制,當(dāng)面臨病原微生物入侵時(shí),低溫誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增值減少將導(dǎo)致適應(yīng)性免疫相對(duì)滯后且免疫應(yīng)答能效較低,因此對(duì)棲息于病原體較多的水環(huán)境魚類而言,先天性免疫在抵御病原體侵染的過程中扮演更為重要的角色[28]. 作為Toll樣受體基因家族中的重要成員,TLR1、TLR9分別可以識(shí)別三?；摹⒓?xì)菌與病毒非甲基化的CpG寡核苷酸序列,盡管在魚類免疫識(shí)別應(yīng)答方面的功能已被廣泛的研究,但是基因的分子進(jìn)化基礎(chǔ)尚不清楚. 目前,已經(jīng)報(bào)道了鱸形目物種容易受到不同的病原微生物的感染,包括真鯛虹彩病毒(RSIV)、鱸魚虹彩病毒(WVIV)、淋巴囊腫病毒(LCDV)、紅細(xì)胞壞死病毒(VENV)、傳染性胰腺壞死病病毒(IPNV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、神經(jīng)壞死癥病毒(NNV)等[25,30]. 本研究通過分析鱸形目物種先天免疫相關(guān)基因TLR1、TLR9的進(jìn)化模式,發(fā)現(xiàn)物種普遍受到顯著的正選擇. 在位點(diǎn)模型中,TLR1與TLR9中被兩種以上方法檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)分別為18、6個(gè),且86%位點(diǎn)處于LRR區(qū). 已報(bào)道LRR結(jié)構(gòu)域在識(shí)別病原體組分中發(fā)揮核心作用,且LRR和LRR_CT區(qū)域還參與病原體刺激后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[31]. 該區(qū)檢測(cè)到更多正選擇位點(diǎn)可能有利于物種在進(jìn)化過程中識(shí)別不同的配體進(jìn)而有效的抵抗病原微生物. 另外,相比于LRR區(qū),TIR區(qū)具有更高的保守性,并且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用. 鱸形目物種在TIR結(jié)構(gòu)域未檢測(cè)到正選擇位點(diǎn),提示該區(qū)域可能受到強(qiáng)烈的功能約束.

特別重要的是,也在鱸形目一些支系中檢測(cè)到特有的正選擇信號(hào),并且檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)與位點(diǎn)模型所檢測(cè)到的位點(diǎn)不同,這些支系可能經(jīng)歷了更多的選擇來應(yīng)對(duì)不同病原體的感染. 兩個(gè)基因在鯛科的最近共同祖先支均檢測(cè)到正選擇信號(hào),之前研究也證明鯛科物種經(jīng)常感染淋巴囊腫病、病毒性表皮壞死病等[25]. 石斑魚屬是環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)的暖水性魚類,尤其是斜帶石斑魚,生活溫度可以在11～41 ℃之間. 目前,病毒性神經(jīng)壞死癥是石斑魚流行病之一[32],研究也在兩個(gè)石斑魚屬物種(斜帶石斑魚、鞍帶石斑魚)的祖先支檢測(cè)到TLR1基因正選擇的信號(hào),可能與其獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)能力有關(guān). 另外,河鱸科物種被列為病毒性出血性敗血癥的易感物種[33]. 作為全球有鰭魚類致病性最強(qiáng)的病毒性疾病之一,宿主致死率可高達(dá)90%,在河鱸科物種的祖先支中也檢測(cè)到TLR9基因存在正選擇信號(hào). 這些物種檢測(cè)到顯著的正選擇信號(hào),表明隨著時(shí)間的推移,物種抗病毒免疫反應(yīng)可能已經(jīng)發(fā)生了進(jìn)化(圖1,表4),提示鱸形目物種TLR1、TLR9的分子進(jìn)化可能是由環(huán)境中的病原微生物介導(dǎo)的選擇壓力所驅(qū)動(dòng)的,從而具有較強(qiáng)的抵御病原微生物侵襲的能力.

另外,兩個(gè)基因受正選擇的比例也明顯不同,在TLR1中檢測(cè)到更多的正選擇信號(hào),并且系統(tǒng)發(fā)育樹也表明TLR1基因樹與物種樹相比,發(fā)生了更多的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化,表明魚類在適應(yīng)病原微生物的過程中,TLR1、TLR9基因受到不同的選擇機(jī)制且TLR1進(jìn)化更為明顯. 本研究也發(fā)現(xiàn)58%的正選擇位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)重要功能域,并且大多數(shù)位于病原體識(shí)別區(qū)域亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRRs),該區(qū)域的進(jìn)化有利于識(shí)別不同病原體PAMP,從而在抗病原免疫過程中發(fā)揮重要作用(圖4). 以上研究結(jié)果從進(jìn)化的角度初步揭示了鱸形目物種先天性免疫基因TLR1、TLR9與病原體的相關(guān)性,為物種的疾病防治與預(yù)防提供理論依據(jù).