胡江鋒 張小娟 胡春艷 白劍英

（1.楊凌綠方生物工程有限公司，陜西西安 712100；2.陜西省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，陜西西安 712100；3.陜西諾威利華生物科技有限公司，陜西西安 712100）

雞新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞和火雞，其他禽類和野禽也能感染，亦可感染人。該病該病常引起敗血癥，其特征是呼吸困難、下痢和神經(jīng)癥狀，死亡率高，可造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。該病是雞病中危害最嚴重的一種疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。雞傳染性支氣管炎（IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道疾病，各雞齡均易感，雛雞以喘氣為突出癥狀，產(chǎn)蛋雞蛋產(chǎn)量和品質(zhì)下降，是目前危害我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要疫病之一[1]。

隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，特別是集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的興起，如何防控雞新城疫和雞傳染性支氣管炎尤為重要。動物疫病防控的主要環(huán)節(jié)是消滅傳染源、切斷傳播途徑和保護易感畜禽，疫苗免疫是保護畜禽健康的重要措施[3]。免疫效果受疫苗質(zhì)量的影響較大，而衡量疫苗質(zhì)量是根據(jù)檢驗結(jié)果判定的。我國生產(chǎn)的疫苗有活疫苗和滅活疫苗兩大類，活疫苗用在雞群前期的基礎(chǔ)免疫，滅活疫苗用在雞群后期的加強免疫。目前，預(yù)防以上兩種疫病的基礎(chǔ)免疫常采用“雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗”，疫苗效力檢驗參照《雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗制造及檢驗規(guī)程》（以下簡稱 《規(guī)程》），具體是將疫苗先進行適當稀釋，再分別與相應(yīng)的陽性血清等量混合，室溫中和1h，之后繼續(xù)稀釋，取3 個適宜稀釋度分別尿囊腔接種10 日齡健康敏感雞胚5 枚，0.1mL/胚，37℃孵育觀察或測定是否感染，計算EID50，據(jù)標準判定疫苗效力合格與否[4]。我國室溫規(guī)定為10～30℃[5]，在“雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗” 效力檢驗時，疫苗中的病毒與陽性血清的具體中和溫度及采用何種中和方法在《規(guī)程》 中尚未明確規(guī)定。本實驗從中和的方法及溫度方面進行探究，以明確中和條件，指導(dǎo)“雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗” 效力檢驗的實際操作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(LaSota 株+H120株)，以下簡稱疫苗1，批號：20210503，規(guī)格：1000 羽；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(LaSota 株+H52 株)，以下簡稱疫苗2，批號：20210502，規(guī)格：1000 羽。均為楊凌綠方生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 陽性血清

雞新城疫陽性血清，S0 121812；雞傳染性支氣管炎陽性血清，S0021501。均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 SPF 雞胚

SPF 雞蛋購自濟南賽福實驗動物養(yǎng)殖有限公司，經(jīng)楊凌綠方生物工程有限公司前孵化班孵化提供。

1.1.4 主要試劑

生理鹽水、PBS（0.1mol/L，pH 7.0～7.2）、1%雞紅細胞懸液，由陜西省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.5 主要設(shè)備

孵化機，北京市西山孵化設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；微量振蕩器，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗中NDV 的中和效果

按《規(guī)程》 將疫苗1 和疫苗2 用生理鹽水分別稀釋至1 羽份/0.5mL，分別裝入10 支試管中，1mL/管，每管再加入等量雞新城疫陽性血清。分別置于10、15、20、25、30℃的恒溫培養(yǎng)箱和恒溫水浴鍋各1 支中和1h（中間搖1 次），此時疫苗為0.1 羽份/0.1mL，即10-1。取出試管繼續(xù)10 倍梯度稀釋，取10-1～10-4各稀釋度的稀釋液，分別尿囊腔內(nèi)接種10 日齡SPF 雞胚5 枚，每胚0.1mL。置37℃孵育144h，棄去24h 前的死亡雞胚，取出24～144h 死胚，孵育結(jié)束時查看雞胚有無雞新城疫病毒所致病變，并按紅細胞凝集試驗法測定雞胚液的血凝結(jié)（即HA）[7]，綜合判定疫苗中雞新城疫病毒被中和的程度，組別中的雞胚若無雞新城疫病毒所致病變及HA 陰性，說明疫苗中雞新城疫病毒被完全中和，否則說明雞新城疫病毒未被完全中和。根據(jù)接種后24～144h 死胚及144h 時存活的雞胚中出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育小（接種胎兒比對照最輕胎兒重量低2g 以上）等特異性病變雞胚的總和按Reed-Muench 法計算疫苗中傳染性支氣管炎病毒的EID50[6]。

1.2.2 疫苗中IBV 的中和效果

按《規(guī)程》 將疫苗1 和疫苗2 用生理鹽水分別稀釋至1 羽份/0.5mL，分別裝入10 支試管中，1mL/管，每管再加入等量雞傳染性支氣管炎陽性血清。分別置于10、15、20、25、30℃的恒溫培養(yǎng)箱和恒溫水浴鍋各1 支中和1h（中間搖1 次），此時疫苗為0.1 羽份/0.1mL，即10-1。取出試管繼續(xù)10 倍梯度稀釋，取10-1～10-7各稀釋度的稀釋液，分別尿囊腔內(nèi)接種10 日齡SPF 雞胚5 枚，每胚0.1mL。置37℃孵育120h，棄去接種后48h 內(nèi)死亡的雞胚，隨時取出48～120h 內(nèi)死亡的雞胚，收獲雞胚液，同稀釋度等量混合，至120h 取出活胚，逐個收獲雞胚液，收獲時查看雞胚有無雞傳染性支氣管炎病毒所致死亡情況及活胚是否有出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育?。ń臃N胎兒比對照最輕胎兒重量低2g 以上）病變情況，綜合判定傳染性支氣管炎病毒被中和的程度，組別中的雞胚若無雞傳染性支氣管液病毒所致病變，說明疫苗中的傳染性支氣管液病毒被完全中和，否則說明傳染性支氣管炎病毒未被完全中和。對收獲的雞胚液按紅細胞凝集試驗法分別測定紅細胞凝集價，1:160（微量法1:128）以上判為感染[7]，按Reed-Muench 法計算疫苗中新城疫病毒的EID50[6]。

2 結(jié)果與分析

表1 和表2 為疫苗1 和疫苗2 分別采用溫箱和水浴兩種方法進行雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒中和試驗的結(jié)果。從表1 和表2 可看出，不論是疫苗1 還是疫苗2，在效力檢驗項的病毒中和時間1h 不變的情況下，NDV 和IBV 在與對應(yīng)的陽性血清等量混合后，在20℃以下水浴法和25℃以下溫箱法中和，病毒均不能被對應(yīng)的陽性血清完全中和，造成對預(yù)測另一種病毒的增殖干擾，而且溫度越低影響越大，與資料陳述的大多數(shù)病毒對熱的抵抗力不強，相反，低溫對病毒具有較好的保護作用觀點一致[8]；25℃水浴法能使病毒被對應(yīng)陽性血清完全中和，而25℃的溫箱法卻不能完全中和病毒，這是由于水的導(dǎo)熱系數(shù)比空氣的導(dǎo)熱系數(shù)大20 多倍，病毒與陽性血清的中和樣在相同溫度的水里比空氣里能較快達到目的溫度，一定時間內(nèi)，病毒與對應(yīng)陽性血清采用水浴法比溫箱法中和較完全；病毒和陽性血清在30℃中和時，2 種方法均能達到病毒被對應(yīng)陽性血清完全中和，但30℃中和卻對另一種病毒造成傷害，這是由于熱能可促使病毒新陳代謝，自然環(huán)境中（不在宿主細胞內(nèi)）經(jīng)過一定時間使其失活。綜上，由于NDV 和IBV存在相互干擾增殖的拮抗特性，為保證“雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗” 效力檢驗項病毒測定結(jié)果的真實性，必須在達到一種病毒完全被中和的條件下，再測定另一種病毒含量，且還需考慮過高的中和溫度對欲測病毒的影響或傷害。

表1 疫苗中NDV 中和后測得IBV 的EID50

表2 疫苗中IBV 中和后測得NDV 的EID50

3 結(jié)論與討論

在集約化規(guī)模化養(yǎng)禽中，若忽視預(yù)防優(yōu)先措施，會使養(yǎng)禽業(yè)完全陷于被動局面。家禽防疫著眼點應(yīng)是使整個群體具有較高的健康水平，而疫苗免疫是提高機體抵抗疫病的有力保障。高質(zhì)量的疫苗是防疫的基礎(chǔ)，判定疫苗質(zhì)量需依靠檢驗數(shù)值，因而，疫苗質(zhì)量檢驗數(shù)值的真實性尤為重要。根據(jù)試驗結(jié)果，作者認為在進行“雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗” 效力檢驗項病毒中和時，中和條件以25℃水浴法中和1h 較為合適，這樣不但能達到病毒完全被中和的目的，也避免了中和溫度過高而影響病毒含量測定結(jié)果的準確性，保證了疫苗檢驗結(jié)果的真實可靠。病毒中和效果受病毒含量、陽性血清中和效價、中和溫度、中和時間、中和方法等因素影響，是否受《規(guī)程》 規(guī)定的時間和溫度限制還需進一步研究。