■王硯妮 李 敏 黃 滿 段先莉 王永澤 趙錦芳

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢 430068）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，除作為維生素A 的前體外，其主要的生物活性功能有抗氧化、抗炎、預(yù)防癌癥和免疫反應(yīng)特性，廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健品和動物飼料等領(lǐng)域。類胡蘿卜素可通過植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵3 種途徑獲得，其中微生物發(fā)酵法因其無毒無害、影響因素少、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，具有廣闊的開發(fā)前景[1]。

目前，國內(nèi)外微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿素的菌種主要有霉菌類、酵母類、細(xì)菌類和藻類[2]。其中，紅酵母屬主要有海洋膠紅酵母（R. mucilaginosaD）[3-6]、粘紅酵母（R. glutinis）[7-8]、深紅酵母（R. rubra）[9]、法夫紅酵母（Phaffia rhodozyma）[10]、小紅酵母（R. minuta）[11]和瘦果紅酵母（R. acheniorum）[12]等。由于紅酵母對營養(yǎng)要求較簡單，國內(nèi)外大量研究集中在利用工業(yè)廢料和農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素上，以降低其生產(chǎn)成本，增加市場競爭力。研究證實甘蔗汁、玉米漿、糖蜜、啤酒糟、洋蔥皮和綠豆殼[5]、馬鈴薯加工廢水[13]等都可作為紅酵母發(fā)酵的培養(yǎng)基成分。

玉米漿（corn steep liquor，CSL）和葡萄糖廢液（glucose mother liquor，GML）是玉米淀粉加工過程中的兩大副產(chǎn)物，玉米漿為玉米的亞硫酸浸泡液，經(jīng)真空濃縮后得到的黃褐色液體，含有可溶性蛋白、多種氨基酸、無機鹽、生長因子及前體物質(zhì)等，可用作水溶性植物蛋白、復(fù)合肥料添加劑和纖維飼料[14]。在生物制藥、氨基酸發(fā)酵和酶制劑等領(lǐng)域中，常被用作廉價高效的有機氮源使用，以節(jié)約生產(chǎn)成本，提高玉米漿的附加值[15-16]。葡萄糖廢液是玉米淀粉加工生產(chǎn)結(jié)晶葡萄糖的過程中產(chǎn)生的，其固形物含量為40%～55%，其中除葡萄糖外還含有大量的低聚糖組分[17]。每生產(chǎn)100 萬噸結(jié)晶葡萄糖約產(chǎn)生20 萬噸葡萄糖廢液。兩種副產(chǎn)物外賣價格低，儲存期易變質(zhì)，環(huán)保和庫存壓力大。如何合理、有效地回收利用CSL 和GML，是玉米深加工產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的關(guān)鍵問題。利用CSL為氮源，GML為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白酵母增色飼料是一種有效途徑。

本研究以海洋膠紅酵母（R. mucilaginosaD）為出發(fā)菌株，在實驗室前期優(yōu)化培養(yǎng)基組分、控制發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上[18-20]，進(jìn)一步對其利用CSL 和GML 生產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，為后續(xù)中試規(guī)模生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

海洋膠紅酵母（R. mucilaginosaD），由本實驗室分離篩選獲得，保藏于湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室。

1.1.2 試劑

玉米漿（CSL）和葡萄糖廢液（GML）由山東某藥業(yè)公司提供，新鮮制備，4 ℃儲藏。CSL為玉米的亞硫酸浸泡液，經(jīng)真空濃縮后得到的黃褐色液體，其中固形物含量6.5%，總氮含量約為1%；GML 為葡萄糖母液經(jīng)部分回收及濃縮后得到的液體，葡萄糖含量約為50%；酵母粉、蛋白胨和瓊脂粉為進(jìn)口（OXOID公司），其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。番茄汁自制，花生油為食用級。

1.1.3 主要儀器

7 L 發(fā)酵罐（sartorius stedim Biotech GmbH37070 Gottigen Germany）；100 L 發(fā)酵罐（GUJS-15-100C，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；生物傳感分析儀（SBA-40D，山東省科學(xué)研究院），分光光度計[WF J 2000，尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基（g/L）：麥芽汁50、葡萄糖20、酵母粉20、瓊脂20，pH自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10、蛋白胨10、酵母粉0.5，pH自然。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：GML 8%、CSL 33%，pH自然。

7 L發(fā)酵培養(yǎng)基：GML、CSL適量，pH自然。

100 L 發(fā)酵培養(yǎng)基：GML 13%、CSL 42%、K2HPO45.5 g、MgSO427.5 g、（NH4）2SO4110 g、甘油1‰，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

種子培養(yǎng)：將海洋膠紅酵母菌株（R. mucilaginosaD）從保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到斜面活化培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h 之后，接2 環(huán)菌苔于種子培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩（200 r/min）培養(yǎng)18 h至對數(shù)生長期。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量50 mL/250 mL 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%，然后分別添加比例為1‰的甘油、番茄汁和花生油，28 ℃振蕩（200 r/min）培養(yǎng)72 h，測定生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量?？瞻讓φ眨–K）為純化水，3次重復(fù)。

7 L發(fā)酵罐：發(fā)酵罐中裝液量4 L，接種量10%，設(shè)置不同的溶氧條件和干物質(zhì)含量，溫度28 ℃，72 h時取樣，測定生物量和類胡蘿卜素含量，重復(fù)3次。

100 L 發(fā)酵罐：發(fā)酵罐中裝液量60 L，接種量10%，溫度28 ℃，溶氧量20%～30%。每4 h取樣，測定OD600nm、pH、殘?zhí)呛皖惡}卜素產(chǎn)量。

1.2.2 類胡蘿卜素產(chǎn)量測定

酸熱破壁法[18]：取4 mL 發(fā)酵液，3 500 r/min 離心15 min得到濕菌體，加入6 mL 3 mol/L HCl溶液，室溫下振蕩浸泡1 h，在沸水浴中煮沸4 min，迅速冷卻后于3 500 r/min離心15 min。棄去上清液，沉淀用純化水洗2～3次后加入5 mL丙酮，室溫下振蕩以浸提類胡蘿卜素，然后3 500 r/min離心15 min，所得上清液即為類胡蘿卜素提取液。重復(fù)3次，以保證色素提取完全。

將提取液適當(dāng)稀釋后用分光光度計在最大吸收波長475 nm處測定吸光度，按公式計算類胡蘿卜素產(chǎn)量。

單位體積發(fā)酵液的類胡蘿卜產(chǎn)量（μg/mL）=A×D×V/0.16×W

式中：A——類胡蘿卜素最大波長處的吸光度；

D——色素浸提液稀釋倍數(shù)；

V——浸提所用溶劑的總體積（mL）；

W——提取所用的發(fā)酵液體積（mL）；

0.16——胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞生物量測定方法

參照羅璇等[21]的干重法：取5 mL發(fā)酵液，3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，加入30 mL 的純化水分次洗滌，使用四層紗布過濾得到菌液，離心得濕菌體，60 ℃烘箱中烘干至恒重，然后稱取干菌體的重量即生物量。

1.2.4 殘?zhí)菨舛葴y定

用SBA-40D 生物傳感儀測定，標(biāo)準(zhǔn)樣品為100 mg/dL葡萄糖，具體方法為：運行儀器進(jìn)行自動清洗，自動定標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行樣品測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0（Statistical Product and Service Solutions）進(jìn)行方差分析，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05，實驗數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 促進(jìn)因子對海洋膠紅酵母發(fā)酵的影響（見圖1）

圖1 促進(jìn)因子對紅酵母發(fā)酵的影響

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[7，22]，金屬離子、維生素、番茄汁、花生油、棉籽油等對紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素有不同程度的促進(jìn)作用。在前期研究中，通過單因素實驗確定了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖廢液添加量8%，玉米漿添加量33.3%，在此基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中分別添加1‰的甘油、番茄汁和花生油，考察3種促進(jìn)因子對海洋膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，發(fā)酵結(jié)果如圖1所示。

甘油可作為微生物發(fā)酵的碳源，有研究證實甘油可作為酵母菌滲透壓穩(wěn)定劑[23]。本實驗中，添加1‰甘油能顯著提高紅酵母生物量（圖1b），與CK組相比提高了58.19%，類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了19.11%，達(dá)到6.54 mg/L。推測主要原因是在高滲環(huán)境中，其能維持紅酵母細(xì)胞滲透壓的平衡，同時參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)并由此影響細(xì)胞膜的通透性。

添加番茄汁和花生油后，紅酵母生物量和色素產(chǎn)量也均有所提高，其中添加1‰番茄汁，R. mucilaginosaD 類胡蘿卜素產(chǎn)量和生物量分別比CK 組提高了12.2%和13.5%。番茄汁中含有合成類胡蘿卜素的前體物質(zhì)八氫番茄紅素和四氫番茄紅素，它們經(jīng)過環(huán)化作用形成β-類胡蘿卜素，因此對菌體合成類胡蘿卜素有促進(jìn)作用；向培養(yǎng)基內(nèi)添加花生油時，可能是由于類胡蘿卜素在生物體內(nèi)一般以油滴形式儲存，所以會影響紅酵母的脂類代謝，加快菌體生長，同時對類胡蘿卜素的生成有一定促進(jìn)作用[22]。

2.2 溶氧量對海洋膠紅酵母發(fā)酵的影響（見表1）

在7 L發(fā)酵罐中，GML 8%、甘油1‰，通過改變轉(zhuǎn)速和通氣量，設(shè)置不同的溶氧條件：0～10%、10%～20%、20%～30%，研究溶氧對海洋膠紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。發(fā)酵結(jié)果見表1。酵母菌生長和發(fā)酵過程中，溶氧量的控制極為重要。由表1可見，溶氧量與類胡蘿卜素產(chǎn)量之間呈正相關(guān)。在溶氧量為0～10%時，海洋膠紅酵母的類胡蘿卜素產(chǎn)量很低，僅有3.83 mg/L，因為較低的溶氧量不利于菌體對氧的充分吸收，影響了色素的產(chǎn)生。在溶氧量為20%～30%時，海洋膠紅酵母的類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到15.16 mg/L，此時的生物量也最高。說明，高溶氧量適宜紅酵母菌體的生長，并有利于類胡蘿卜素的生成。因此，將溶氧控制在20%～30%為佳。

表1 不同溶氧對紅酵母發(fā)酵的影響

2.3 固形物含量對海洋膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響（見表2）

表2 固形物含量對紅酵母發(fā)酵的影響

類胡蘿卜素產(chǎn)量與發(fā)酵原料的營養(yǎng)含量有很大關(guān)系，本研究CSL和GML中均含有一定量的不溶性固形物，在7 L發(fā)酵罐中，通過調(diào)整兩者添加配比，研究不同固形物含量對海洋膠紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。發(fā)酵結(jié)果見表2。

CSL（氮源）和GML（碳源）中均有不溶性物質(zhì)，通過調(diào)整兩者比例，使固形物含量分別為8%、11%和14%。隨著固形物含量的增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)基中固形物含量為8%時，CSL 和GML 的濃度均較低，此時營養(yǎng)成分較少，菌株的生長和代謝能力弱，因而所得生物量和色素產(chǎn)量均較低；當(dāng)增加CSL 和GML 的配比，使固形物含量為11%時，充足的營養(yǎng)成分促進(jìn)菌體細(xì)胞的生長，OD600nm達(dá)到最大值150，類胡蘿卜素產(chǎn)量為25.77 mg/L。進(jìn)一步提高固形物含量至14%時，OD600nm和類胡蘿卜素產(chǎn)量均下降，主要原因是高濃度的CSL 和GML 導(dǎo)致滲透壓增大，對紅酵母菌體的生長和類胡蘿卜素的形成產(chǎn)生一定的抑制作用。因此固形物含量為11%時效果最佳，即CSL 42%、GML 13%。

2.4 100 L發(fā)酵罐實驗（見圖2）

圖2 海洋膠紅酵母100 L發(fā)酵罐結(jié)果

在100 L 發(fā)酵罐中，固形物含量11%，甘油1‰，通氣攪拌發(fā)酵使溶氧量維持在20%～30%，發(fā)酵過程中定時取樣，檢測殘?zhí)?、pH、OD600nm和類胡蘿卜素產(chǎn)量的變化，結(jié)果如圖2所示。

發(fā)酵過程中pH不做調(diào)整，基本在3.5～4.5之間小幅變動。發(fā)酵液中有植酸的存在，對酵母生長和類胡蘿卜素的產(chǎn)生是不利因素，后期考慮采用方法去除原料中的植酸。

由圖2可知，從殘?zhí)堑淖兓梢钥闯?，發(fā)酵至8 h時，菌體進(jìn)入對數(shù)生長期（8～28 h），這一階段葡萄糖的利用速率加快，濃度隨著發(fā)酵時間的增加急劇下降，至24 h 時完全被消耗。隨著OD600nm值的變化，類胡蘿卜素產(chǎn)量迅速升高，兩者的增長趨勢保持一致。至28 h時，OD600nm達(dá)到最大148.4，類胡蘿卜素產(chǎn)量也達(dá)到最大值26.17 mg/L，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm和pH 基本維持不變。達(dá)到最大值后，殘?zhí)堑目焖傧氖诡惡}卜素產(chǎn)量出現(xiàn)小幅下降趨勢。發(fā)酵過程中菌株的生長（OD600nm）和類胡蘿卜素產(chǎn)量的變化趨勢保持一致，這與Ghilardi等[4]報道的結(jié)果一致。

利用工農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素是近幾年研究的熱點方向。不同菌株以不同的農(nóng)產(chǎn)品加工廢物為發(fā)酵原料所產(chǎn)生的類胡蘿卜素含量差異明顯。Marova等[24]研究R. mucilaginosaCCY 20-7-31利用合成培養(yǎng)基（酵母提取物、維生素、馬鈴薯廢料）作為營養(yǎng)物，同時添加過氧化物和5%鹽脅迫，經(jīng)有氧發(fā)酵生物量最高達(dá)30 g/L，β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)到56 mg/L。Anna等[13]研究不同紅酵母利用馬鈴薯廢水和3%的甘油作為碳源，在5%NaCl鹽脅迫、5 mmol/L H2O2脅迫條件下生產(chǎn)類胡蘿卜素，發(fā)酵120 h后的產(chǎn)物進(jìn)行噴霧干燥，R. glutinisLOCKR13、R. mucilaginosaATCC 66034和R. gracilisATCC 10788的總類胡蘿卜素含量分別為280.3、150.7 μg/g（干基）和360.4 μg/g（干基）。Sinisa 等[25]研究Sporobolomyces roseus以咖啡渣為碳源進(jìn)行分批補料發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，發(fā)酵41～48 h 類胡蘿卜素含量最大為41 g/L。2021年，Luis等[26]研究不同紅酵母利用甜菜渣（SBP）水解物為碳源，有氧發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，經(jīng)過144 h 發(fā)酵后，R. mucilaginosaIST 390和R. toruloidesPYCC 5615的總類胡蘿卜素產(chǎn)量分別為1.4 mg/L 和5.4 mg/L。Aksu[27]等研究R. mucilaginosaNRRL-2502利用兩種農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物為碳源，通過搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素。在最佳發(fā)酵條件下，海洋膠紅酵母以甜菜糖蜜（蔗糖濃度20 g/L）為碳源時，其類胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)到89.0 mg/L，以乳清（乳糖濃度為6.6 g/L）為碳源時，其類胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)到70.0 mg/L。Tabita 等[6]研究R. mucilaginosaCCT 7688利用蔗糖糖蜜（蔗糖濃度70 g/L）和玉米漿（玉米漿濃度3.4 g/L）作為營養(yǎng)物質(zhì)，通過500 mL搖瓶發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素。在25 ℃，180 r/min 的條件下經(jīng)過168 h 發(fā)酵后，類胡蘿卜素的產(chǎn)量可達(dá)到152.5 μg/g。本研究以玉米漿和葡萄糖廢液為發(fā)酵原料，添加促進(jìn)因子、改變?nèi)苎趿亢凸绦挝锖?，?jīng)過28 h發(fā)酵后，類胡蘿卜產(chǎn)量可達(dá)26.17 mg/L。研究表明，紅酵母可利用玉米淀粉加工副產(chǎn)物——玉米漿和葡萄糖廢液發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，既可增加這些副產(chǎn)品的附加值，降低發(fā)酵成本，又可以減少對環(huán)境的影響。

3 結(jié)論

玉米漿（CSL）和葡萄糖廢液（GML）是玉米淀粉加工副產(chǎn)物，本研究對海洋膠紅酵母利用玉米漿和葡萄糖廢液的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：固形物含量11%（GML 13%、CSL 42%）、甘油添加量1‰、10%接種量、溶氧量20%～30%、發(fā)酵溫度28 ℃、pH 自然。類胡蘿卜素的產(chǎn)生主要發(fā)生在對數(shù)生長期，發(fā)酵至28 h時，OD600nm達(dá)到最大值，類胡蘿卜素的產(chǎn)量最高達(dá)到26.17 mg/L。

本研究中海洋膠紅酵母R. mucilaginosaD 能利用玉米淀粉深加工副產(chǎn)物穩(wěn)定生產(chǎn)類胡蘿卜素，綜合前期研究結(jié)果，所得產(chǎn)品粗蛋白含量達(dá)到30%以上，具有進(jìn)一步開發(fā)潛力。本研究為規(guī)?；a(chǎn)高蛋白酵母增色飼料及玉米加工副產(chǎn)物的綜合利用提供技術(shù)參考。