劉松柏，劉鵬，王興，朱昌毫，費(fèi)曉斌，蔡浚哲，潘耀振

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550008）

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一[1]，其惡性程度高、進(jìn)展快、早期診斷困難且預(yù)后極差，被列為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[2-3]。其近期5年總生存率僅為7.7%，中位生存期約為6 個(gè)月[4]，它是美國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，也是全球第七大惡性腫瘤死亡原因[5]。由于胰腺癌早期無(wú)特異性臨床癥狀，絕大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已中晚期。因此，迫切尋找胰腺癌早期診斷和治療的生物標(biāo)記物具有重大意義。原肌球蛋白（TPM）是一種早期被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，以絲狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的形式存在于各種動(dòng)物的細(xì)胞骨架和肌肉細(xì)絲中[6]。原肌球蛋白4（TPM4）是原肌球蛋白家族中肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族的一員，提供肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架功能[7]。此外，肌動(dòng)蛋白-TPM4 微絲對(duì)收縮、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)小泡運(yùn)輸都很重要[8]。目前越來(lái)越多的報(bào)道表明，TPM4參與了腫瘤的發(fā)展[9]，但TPM4 在胰腺癌中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)TPM4 過(guò)表達(dá)或敲低，研究其對(duì)人胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胰腺癌細(xì)胞株：ASPC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、SW1990、HPDE均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPIM1640、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小干擾RNA購(gòu)自于中國(guó)廣州銳博生物科技有限公司，過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)自中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因公司；Lip3000購(gòu)于美國(guó)invitrogen；TPM4抗體購(gòu)于中國(guó)武漢三鷹公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析：通過(guò)TCGA、GEPIA等數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPM4 在胰腺癌中的表達(dá)情況及與患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：所有細(xì)胞均在含10%胎牛血清的DMEM或RPIM1640，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，提取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞MIA PaCa-2、PANC-1，接種2×105個(gè)細(xì)胞于六孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%時(shí)以Lip3000 脂質(zhì)體為介質(zhì)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，先使用無(wú)血清培養(yǎng)基分別孵育Lip3000及siRNA各5 min，隨后將二者混合孵育15 min后緩慢滴入細(xì)胞中，搖勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24～48 h提取RNA，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，48～72 h提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 細(xì)胞慢病毒感染：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞MIA PaCa-2、PANC-1，接種1×105個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后進(jìn)行病毒感染，根據(jù)病毒MOI值將病毒體積吸入培養(yǎng)瓶中，搖勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)TPM4 mRNA表達(dá)水平：收集待測(cè)細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑，提取總RNA。然后使用PrimeScriptTMRT Reagent試劑盒（日本TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄RNA。qRT-PCR分析使用TB Green?Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa）。選擇GAPDH作為內(nèi)源性參照物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，所有步驟均按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)TPM4蛋白表達(dá)水平：收集待測(cè)細(xì)胞并加入200 μL裂解液（RIPA∶廣譜蛋白酶抑制劑∶磷酸化酶抑制劑∶PMSF=100∶2∶2∶1）。收集蛋白上清液，加入5×loading buffer（蛋白上清液：5×loading buffer=4∶1），95 ℃煮沸10 min。然后將各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行電泳分離，將凝膠中電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜3 次后放入1∶1 000 稀釋的TPM4 抗體于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入二抗繼續(xù)于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行觀察。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞遷移能力：取siRNA干擾或過(guò)表達(dá)MIA PaCa-2、PANC-1細(xì)胞消化離心并接種于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)孔徑時(shí)，將直尺置于孔徑上方，移液槍進(jìn)行劃痕，PBS洗滌2次后于顯微鏡下進(jìn)行拍照，并放置培養(yǎng)箱48 h后再次進(jìn)行拍照，最后對(duì)各組細(xì)胞相對(duì)遷移距離進(jìn)行比較。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力：取siRNA干擾或過(guò)表達(dá)MIA PaCa-2、PANC-1細(xì)胞消化離心并調(diào)整密度為2×105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于含或不含基質(zhì)膠（Matrigel膠∶無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基=1∶8）的上室內(nèi)，下室加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，PBS清洗2遍，1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗2遍，1 mL 0.3%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗后烘干，最后顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPM4在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)TCGA、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選成對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示TPM4 基因在胰腺癌中高表達(dá)，且與胰腺癌患者總體生存率及無(wú)病生存率呈負(fù)相關(guān)（見(jiàn)圖1A～C），進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR對(duì)胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：與HPDE相比，TPM4在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，其中以MIA PaCa-2、PANC-1 細(xì)胞最為顯著（見(jiàn)圖1D），因此選擇這兩株細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 TPM4在TCGA、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)及胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)

2.2 TPM4轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平

針對(duì)以上結(jié)果，我們將siRNA及過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染MIA PaCa-2、PANC-1細(xì)胞，采用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：與對(duì)照組si-NC相比，敲低組三條si-TPM4表達(dá)量均降低，其中以si-TPM4#2最為顯著（圖2A、B），因此選擇si-TPM4#2作為后續(xù)研究。而與Control組相比，過(guò)表達(dá)組顯著上調(diào)TPM4表達(dá)量（見(jiàn)圖2C）。進(jìn)一步通過(guò)Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)組TPM4表達(dá)量明顯高于Control組，敲低組TPM4表達(dá)量明顯低于si-NC組（見(jiàn)圖2D）。這些結(jié)果表明過(guò)表達(dá)及敲低組構(gòu)建成功。

圖2 TPM4 siRNA及穩(wěn)轉(zhuǎn)慢病毒效率驗(yàn)證

2.3 TPM4對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

為進(jìn)一步研究TPM4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，我們首先采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：與Control組相比，過(guò)表達(dá)組胰腺癌細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，而敲低組胰腺癌細(xì)胞遷移能力減弱（圖3A）。接下來(lái)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲遷移能力顯著增強(qiáng)，而敲低組細(xì)胞侵襲遷移能力減弱（圖3B）。這些結(jié)果都表明：過(guò)表達(dá)TPM4能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移。

圖3 TPM4促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移（HE，×100）

3 討論

與其他癌癥不同，胰腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，存活率幾乎沒(méi)有改善，治療中的主要挑戰(zhàn)仍然是患者在確診時(shí)已進(jìn)展為疾病晚期[10]。目前，手術(shù)是胰腺癌唯一潛在的治愈方法，但由于局部和遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的高頻率，單靠手術(shù)治療的方法往往達(dá)不到預(yù)期臨床結(jié)局[11]。原肌球蛋白（TPM）是一類(lèi)肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白家族，它沿著肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的主要α螺旋溝槽形成卷曲二聚體[12]，與肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白等其他肌節(jié)蛋白一起在調(diào)節(jié)肌肉收縮中發(fā)揮重要作用[13]，在哺乳動(dòng)物中，原肌球蛋白由4個(gè)不同的基因編碼：TPM1、TPM2、TPM3和TPM4組成[14]。據(jù)報(bào)道，TPM4被認(rèn)為是幾種癌癥的潛在標(biāo)志物，如卵巢癌患者血清中TPM4 水平較對(duì)照組升高[15]，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，TPM4在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常結(jié)腸組織和細(xì)胞系[16]，而TPM4在肝癌組織[17]、食道癌組織[18]中的表達(dá)高于正常組織。此外，TPM4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，通過(guò)調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白的形成促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移[19]。敲低TPM4 能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[20]。沉默TPM4 的表達(dá)能顯著抑制胃癌細(xì)胞的體外侵襲、遷移能力[21]。

為進(jìn)一步研究TPM4 是否參與調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞侵襲、遷移。我們首先通過(guò)生物信息對(duì)TCGA、GEPIA等數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)TPM4基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共享的大量樣本中癌組織的mRNA表達(dá)豐度顯著高于癌旁組織，并與臨床總生存率和無(wú)病生存率密切相關(guān)，提示TPM4 可能在胰腺癌中可能發(fā)揮致癌作用。其次，我們通過(guò)qRT-PCR對(duì)胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TPM4 在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，提示TPM4 有望成為胰腺癌潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。最后我們通過(guò)對(duì)TPM4進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲低，研究TPM4對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TPM4促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移，敲低TPM4 則減弱胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移。

總之，我們通過(guò)初步研究TPM4 在胰腺癌細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)TPM4 在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，TPM4 能夠調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移的能力，為胰腺癌早期臨床診斷、預(yù)后等提供參考，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。