孟智鵬，溫青玉，張 雨，李天齊，張康逸

（1. 河南工業(yè)大學 國際教育學院，河南 鄭州 450007；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心/河南省全谷物小麥制品加工國際聯(lián)合實驗室/河南省全谷物鮮食加工工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；3. 河南省安康食品科技研究院，河南 鄭州 450047；4. 河南省安康未來食品科技有限公司，河南 鄭州 450066）

隨著世界范圍內(nèi)食物過敏發(fā)病率的不斷上升[1?2]，食物過敏已成為人們重點關注的食品安全問題之一。小麥是全球最重要的糧食作物之一，也是8 種主要的食物過敏原中較為重要的一類[3]。據(jù)研究，小麥食物過敏致敏率已接近全球人口的1%：在兒童中的致敏率為0.4%～1.3%，在成人中的致敏率為0.2%～0.9%[4]。小麥醇溶蛋白（GLI）被認為是引起小麥食物過敏的主要過敏原[5]。

酶法處理過敏原是目前高效降低致敏性的手段之一，主要原理是通過部分或完全地將過敏蛋白水解成肽或者氨基酸，進一步破壞過敏原的線性表位和構象表位，從而達到降低致敏性的效果[6]。KASERA 等[7]研究了酶水解對蕓豆、黑豆和花生等3種豆類致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)酶水解可有效減弱豆類蛋白的過敏性；CUADRADO 等[8]通過研究蛋白酶對腰果和開心果的酶解反應，發(fā)現(xiàn)酶解反應顯著降低了腰果與開心果過敏原結(jié)合IgE 的能力。值得注意的是，如果酶解條件不適宜，可能會暴露出更多的抗原表位，反而會提高過敏原的致敏性[9]。目前，有研究者發(fā)現(xiàn)通過酶解法也可降低GLI致敏性[10?11]，但降低GLI 致敏性的最佳酶解工藝以及酶解與GLI致敏性的關系還有待進一步探究。

為深入研究酶解改性對GLI的影響并達到最佳的降敏效果，以致敏性特征值OD450為評價指標，從6 種蛋白酶中篩選出合適的2 種酶，以OD450和水解度（DH）為指標設計單因素試驗，并在此基礎上通過響應面試驗對酶解的工藝進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)的酶法改性配方；同時，通過SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、Western blot 和ELISA 試驗進一步探究酶法改性對GLI致敏性的影響。以期為開發(fā)低致敏小麥產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時也為其他食物過敏原致敏性的降低或消除提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

GLI 購自上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶購自Novozymes 公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒、山羊抗兔IgG-HRP 購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；2×Tricine-SDS-PAGE 蛋白質(zhì)上樣緩沖液、三（羥甲基）甲基甘氨酸（Tricine）、TMB 顯色液、DAB顯色液、考馬斯亮藍G-250、蛋白質(zhì)Marker 等均購自Solarbio公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單酶篩選 選取6 種蛋白酶對GLI 進行酶解。稱取一定量GLI，加入蒸餾水攪拌制備成30 g/L的懸浮液，在表1 中各酶的最適溫度與pH 值條件下，添加酶（酶活性設定為3 000 U/g）進行酶解反應4 h。反應過程中維持pH 值在最適范圍內(nèi)。酶解結(jié)束后，95 ℃水浴10 min。

表1 不同蛋白酶的酶解反應最適條件Tab.1 Optimal enzymatic parameters of various proteases

1.2.2 酶解單因素試驗 以致敏性特征值OD450和水解度為評價指標，主要考察各單因素包括酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g）、酶解pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、底物質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50 g/L）以及酶解時間（2、3、4、5、6 h）對GLI致敏性的影響。

1.2.3 雙酶酶解工藝優(yōu)化試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，以致敏性特征值OD450為評價指標，采用Design Expert 8.0.6 軟件設計響應面試驗，進一步優(yōu)化酶添加量（A）、酶解pH值（B）、酶解溫度（C）、底物質(zhì)量濃度（D）4 個因素對GLI 致敏性的影響，從而得出最佳酶解工藝。以-1、0、1 分別代表變量的水平，試驗設計的響應面因素和水平見表2。

表2 響應面法優(yōu)化GLI酶解條件的因素和水平Tab.2 Factors and levels of optimization of GLI enzymatic hydrolysis conditions by response surface methodology

1.3 測定方法

1.3.1 水解度測定 借鑒范三紅等[12]的方法采用甲醛滴定法測定蛋白質(zhì)水解度。

1.3.2 兔抗GLI多克隆抗體制備及抗原性評估

1.3.2.1 多克隆抗體制備 選取4 只8 周齡且健康的日本大耳兔，使用不含過敏原的飼料喂養(yǎng)，采用靜脈多點注射進行免疫。用PBS（pH 值為7.0，0.01 mol/L）稀釋過敏蛋白GLI，首次免疫使用等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，免疫劑量為每只兔2 mg/mL；之后每隔14 d 進行一次加強免疫，加強免疫使用弗氏不完全佐劑進行乳化，免疫劑量為每只兔0.5 mg/L。效價達標后，從動脈大量取血，37 ℃凝血1 h 后，4 ℃放置過夜，分離血清（4 000 r/min 離心3 min），-20 ℃凍存?zhèn)溆肹13]。

1.3.2.2 ELISA 測定 借鑒韓建勛[14]的方法并進行改進，采用ELISA 評估GLI 的抗原性。取100 μL 樣品（2 μg/mL，用包被液稀釋）至96孔微量酶標板，每個稀釋度設置6 個平行，在4 ℃下包被過夜；之后每孔加100 μL 含5%脫脂奶粉的封閉液，在37 ℃下封閉2 h；再加入100 μL兔抗GLI多克隆抗體（用PBST稀釋100 000倍），37 ℃孵育1 h；加入100 μL羊抗兔IgG-HRP（用PBST 稀釋3 000 倍），37 ℃孵育1 h；以上每個步驟處理后均用PBST 洗板3 次并拍干。最后加入100 μL TMB 顯色液，避光顯色10 min 后，加入50 μL 2 mol/L 的H2SO4終止反應，使用酶標儀（Multiskan?FC，Thermo公司）讀取450 nm處的吸光值，記作OD450。

1.3.3 SDS-PAGE 和Tricine-SDS-PAGE 電泳 將GLI 溶液及其酶解液稀釋為0.5 g/L，與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合，沸水浴加熱8 min，以10 000 r/min離心1 min。制備5%濃縮膠和12%分離膠，使用DYCZ-24D 蛋白質(zhì)電泳儀進行SDS-PAGE 電泳。制備4%濃縮膠、10%夾層膠和16.5%分離膠，使用DYCZ-40D 轉(zhuǎn)印電泳儀進行Tricine-SDS-PAGE 電泳，然后將分離膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定1 h。電泳結(jié)束后進行染色、脫色和拍照。

1.3.4 Western blot 分析 參考MENG 等[15]的方法，用SDS-PAGE 電泳將待測樣品分離，方法同1.3.3，然后將分離膠上的蛋白質(zhì)條帶經(jīng)過濕法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用封閉液于室溫下封閉2 h 后洗滌，之后將膜轉(zhuǎn)移至經(jīng)稀釋的兔抗GLI 多克隆抗體（用PBST 稀釋10 000 倍）中，在37 ℃下?lián)u動孵育2 h 后洗滌；然后，再將膜轉(zhuǎn)移至山羊抗兔IgG-HRP（用PBST 稀釋2 000 倍）稀釋液中，在37 ℃下?lián)u動孵育1 h 后洗滌。洗滌方法均為用PBST 振蕩洗滌3 次，每次6 min。最后加入DAB 顯色液避光搖動顯色，顯色至預期效果，用蒸餾水清洗，終止反應，將膜晾干后進行拍照。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 用Origin 9.0、SPSS 23 和Design Expert 8.0.6等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶篩選結(jié)果

由圖1可知，經(jīng)不同酶解后，GLI的OD450均有不同程度的降低，說明酶解對降低GLI 的致敏性有顯著效果。尤其經(jīng)堿性蛋白酶、復合蛋白酶水解后，OD450降低程度最大，分別降至0.536 2、0.580 1，說明其降低致敏性效果最佳。因此，本研究選擇堿性蛋白酶、復合蛋白酶等比添加進行后續(xù)的雙酶酶解試驗。

圖1 6種酶對GLI OD450的影響Fig.1 The effects of six enzymes on OD450 of GLI

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2A 所示，隨著酶添加量的增加，水解度逐漸升高然后趨于平緩，但OD450呈現(xiàn)先減小后增大趨勢，在3 000 U/g 時降敏效果最佳，繼續(xù)增加酶添加量可以進一步增加水解度，但降敏效果反而變差。在圖2B、C、D 中，隨pH 值、溫度和底物質(zhì)量濃度的增加，水解度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，分別在pH 值7.5、50 ℃和30 g/L 的底物質(zhì)量濃度條件下達到最大值，而OD450變化與水解度均呈相反趨勢，水解度最大時OD450最小，隨著水解度的降低，致敏性又逐漸增大。在圖2E 中，隨著酶解時間的增加，水解度同樣逐漸升高然后趨于平緩，4 h 時水解度與致敏性降低效果均達到最大，4 h 后再繼續(xù)酶解，致敏性效果并沒有明顯變化。因此，確定4 h 為最佳酶解時間。為了進一步研究降低GLI致敏性的最佳酶解工藝，對除酶解時間之外的另外4 種因素進一步進行響應面分析。

圖2 酶添加量（A）、酶解pH值（B）、酶解溫度（C）、底物質(zhì)量濃度（D）和酶解時間（E）對GLI OD450和水解度的影響Fig.2 Effects of enzyme addition amount（A），enzymatic hydrolysis pH value（B），enzymatic hydrolysis temperature（C），substrate concentration（D）and enzymatic hydrolysis time（E）on the OD450 and hydrolysis degree of GLI

2.3 響應面優(yōu)化設計試驗結(jié)果

在單因素測試的基礎上，運用Design Expert 8.0.6 軟件中Box-Behnken 程序設計進行優(yōu)化，設計四因素三水平，共29組試驗組合。試驗設計方案及結(jié)果如表3所示。

表3 響應面試驗設計方案及結(jié)果Tab.3 The schemes and results of response surface design

通過Design Expert 8.0.6 響應面分析軟件對29組OD450試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到OD450的回歸方程：

OD450=0.369 8-0.004 2A-0.000 3B-0.001 3C+0.004 1D+0.0060AB-0.002 4AC-0.000 9AD-0.006 8BC-0.000 4BD+0.000 8CD+0.012 7A2+0.017 9B2+0.019 6C2+0.011 1D2。

對回歸方程進一步進行方差分析，結(jié)果見表4。由表3、表4 可知，以OD450為響應值的模型中，一次項A、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AB、BC對OD450的影響極顯著（P<0.01）。由此可知，各個因素之間的交互作用比較顯著，各因素對OD450的影響不是簡單的線性關系。由表4 可知，本試驗的回歸方程模型為極顯著水平（P<0.01），該模型的失擬項（P>0.05）不顯著，表明該模型的擬合度較好。因此，該回歸方程可用于OD450的分析。方程的決定系數(shù)R2為0.971 3，表明方程的相關性較好，說明該模型對OD450可以進行預測；修正決定系數(shù)R2Adj為0.943 6，說明該模型可以解釋94.36%的響應值變化；R2Pred（0.863 8）與R2A（dj0.943 6）的差值小于0.2，說明該回歸模型可以充分地解釋GLI的酶解過程。試驗的精確度可以用離散系數(shù)表示[16]，此次試驗的精確度為0.829 0%，說明該方程能夠很好地反映真實值。

表4 響應面方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance results of response surface

響應面是響應值對各試驗因素所構成的三維空間曲面圖，通過曲面的坡度可以看出兩因素交互作用的強弱[17]。研究各試驗因素間的相互作用對OD450的影響，由二次回歸模型繪制的響應面圖如圖3 所示。隨著各試驗因素水平的逐漸升高，OD450均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，說明4 個因素在所設定范圍內(nèi)均存在最值。結(jié)合表4 可知，4 個因素中酶添加量對OD450的影響最大，其次為底物質(zhì)量濃度、酶解溫度、酶解pH值。而且酶添加量和酶解pH值、酶解pH值和酶解溫度的交互作用對OD450影響極顯著（P<0.01），與方差分析結(jié)果一致，其他交互作用影響不顯著（P>0.05）。

圖3 酶添加量、酶解pH值、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度交互的響應面分析Fig.3 Response surface analysis of interaction among enzyme addition amount，enzymatic hydrolysis pH value，temperature and substrate concentration

2.4 最優(yōu)化酶解工藝條件驗證

響應面分析結(jié)果表明，降低GLI 致敏性的最佳酶解工藝：酶添加量為3 080 U/g，底物質(zhì)量濃度為32 g/L，酶解溫度為50.5℃，酶解pH 值為7.48，酶解時間為4 h。在此條件下，通過3 次驗證試驗，OD450由未處理的1.013 2 降至0.363 5。說明該模型具有較好的適用性，可以用來預測試驗結(jié)果。

2.5 GLI酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

通過SDS-PAGE 與Tricine-SDS-PAGE 電泳對GLI 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布進行分析，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過堿性蛋白酶、復合蛋白酶單酶解后，GLI在30～48 ku 的條帶幾乎完全消失，新產(chǎn)生的條帶多集中在3.3～14.4 ku；經(jīng)過最優(yōu)配方酶解后，僅在14.4 ku 附近有部分殘留，更多的條帶被水解成3.3 ku 以下的小肽段，這說明最優(yōu)配方酶解更能有效水解GLI。

圖4 GLI酶解產(chǎn)物SDS-PAGE（A）、Tricine-SDS-PAGE（B）分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE（A），Tricine-SDS-PAGE（B）analysis results of wheat gliadin hydrolysis products

2.6 GLI酶解產(chǎn)物分析

由圖5A可知，GLI經(jīng)過酶解后，OD450顯著降低，尤其在最優(yōu)配方下，OD450最小，說明雙酶酶解最優(yōu)配方降低GLI 致敏性效果最好。通過Western blot進一步驗證，未處理的GLI免疫條帶清晰，但酶解之后幾乎檢測不到條帶（圖5B），再次證明酶法改性降低GLI 致敏性的效果明顯。綜上所述，酶法改性降低GLI 致敏性的效果明顯，最優(yōu)酶配方（雙酶）比單酶降低致敏性效果更佳。

圖5 ELISA（A）和Western blot（B）分析酶法改性對GLI致敏性的影響Fig.5 The effects of enzymatic modification on allergenicity of GLI determined by ELISA（A）and Western blot（B）

3 結(jié)論與討論

探索酶解改性對小麥醇溶蛋白致敏性影響研究具有重要意義。本研究通過酶解改性來降低GLI的致敏性，以致敏性特征值OD450為評價指標，通過單酶篩選，確定堿性蛋白酶和復合蛋白酶對GLI 進行同步酶解。通過單因素試驗與響應面試驗優(yōu)化了雙酶酶解工藝，獲得降低GLI 致敏性的最佳酶解工藝：酶添加量為3 080 U/g，底物質(zhì)量濃度為32 g/L，酶解溫度為50.5 ℃，酶解pH 為值為7.48，酶解時間為4 h。經(jīng)試驗驗證，在此條件下酶解產(chǎn)物的OD450由未處理的1.013 2降至0.363 5。

酶解改性有一定的降低致敏性能力，LIANG等[18]通過酶水解降低了牛奶產(chǎn)品的免疫反應性。而降敏效果與酶解底物、酶種類和酶解條件均有關。本研究用6 種酶分別酶解GLI 后，其OD450差異化的主要因素是各酶酶切位點的不同，而這些酶切位點僅有少數(shù)分布于抗原表位肽段中。酶切位點不同導致抗原表位的暴露情況不同，由此表現(xiàn)出不同的致敏性效果，只有在合適條件下，酶解改性才有顯著的降低致敏性效果。蛋白酶只有在合適的酶解條件下活性最高，在過高或過低pH 值和溫度下，導致部分酶變性，酶活力降低，不利于酶解反應進行[19?20]。隨底物質(zhì)量濃度增加水解度也呈先增大后減小趨勢。當?shù)孜镔|(zhì)量濃度增大時，增大了反應體系的黏度，使得酶在溶液中流動性變差。趙立娜等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)，酶與底物不能充分的接觸會抑制蛋白質(zhì)酶解。另外，單因素研究發(fā)現(xiàn)，水解度與致敏性之間沒有明確聯(lián)系，水解度過低時，通過酶解降低致敏性效果有限。然而過度水解可能導致無致敏性的肽段被分解成更小的肽段，抗原表位暴露，反而產(chǎn)生了致敏性。在HE 等[22]的研究中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，說明適度水解對降低GLI 致敏性很有必要。

SDS-PAGE 和Tricine-SDS-PAGE 電 泳 結(jié) 果 顯示，最優(yōu)條件下雙酶酶解得到分子質(zhì)量低于3.3 ku以下的小肽段，比單酶酶解效果好。范志軍等[23]的研究結(jié)果表明，分子質(zhì)量的降低往往伴隨著致敏表位的降解，可以降低過敏原結(jié)合IgE 的能力，這可能是致敏性降低的主要原因。黨慧杰等[24]提出，蛋白質(zhì)降解的越多，水解度越高，其致敏性越低。然而，水解過度會導致肽段分子質(zhì)量過低，隱藏的抗原表位可能暴露，不利于降低致敏性，這與水解度測定結(jié)果一致。

ELISA 和Western blot 分析進一步評估了酶解改性對GLI 致敏性的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，酶法改性一定程度上破壞了GLI 的線性表位，且最優(yōu)酶配方（雙酶）比單酶降低致敏性的效果更顯著。LI等[10]也得出了相似的結(jié)論，雙酶經(jīng)過合適的配比和酶解路線對過敏蛋白進行酶解，比單酶降低致敏性的效果更顯著。

食物過敏是世界范圍內(nèi)主要的健康問題之一，小麥是我國最重要的谷物之一，不僅作為日常碳水化合物的主要來源，而且也作為具有獨特質(zhì)地的食物來源。小麥醇溶蛋白作為小麥中的主要過敏蛋白，易引起過敏反應，包括蕁麻疹、呼吸不順暢甚至休克或死亡。到目前為止，小麥過敏無法根治，最佳的方法就是盡量避免食用含小麥的食物，但完全避免食用含小麥食物是相當困難的。因此，深入探究降低或消除小麥醇溶蛋白的致敏性顯得格外重要。目前，降低過敏原致敏性手段主要包括物理法、化學法、酶法、生物法，其中，酶解改性方法簡單易于控制，相比其他處理成本較低。為了更深入評價酶解改性對過敏蛋白致敏性的影響，下一步可以建立致敏動物模型進行體內(nèi)評價。另外，過敏蛋白致敏的前提是抗原表位的存在，而表位的構成是某些特定的氨基酸殘基連續(xù)或不連續(xù)組合。后續(xù)可以進行GLI 表位的鑒定，對于深層次研究改性手段與降低過敏蛋白致敏性的機制具有重要意義。