顧艷麗，曹艷子，王效禹，單春喬，劉 艷，2，江國托，2

（1. 大連三儀動物藥品有限公司，遼寧 大連 116036；2. 江蘇三儀生命科學(xué)研究院，江蘇 邳州 221300）

在國家減抗替抗政策背景下，中藥及其復(fù)方因殘留少、毒性小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注。中藥可以通過調(diào)節(jié)增強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)，提升自身抵抗力，從而抵御疾病。但中藥按照傳統(tǒng)的粉碎工藝進(jìn)行處理時并沒有將細(xì)胞壁充分破壞，因此會出現(xiàn)中藥粉劑效果不理想、有效成分含量偏低等問題。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[1?2]，中藥復(fù)方經(jīng)過微生物發(fā)酵后，不僅能夠增強(qiáng)動物消化酶的活性，提高飼料利用率，而且能夠拮抗動物機(jī)體的病原菌，增強(qiáng)免疫力和抗病能力。中藥成分經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化，大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變成為直接被機(jī)體吸收利用的小分子物質(zhì)，使肉雞血液中的有效成分迅速達(dá)到有效濃度，有助于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并且能夠顯著降低腸道中有害菌大腸桿菌的數(shù)量，增加有益菌乳酸菌的含量。

近年來，利用天然植物提取物來維持腸道微生態(tài)平衡以提高動物健康已成為研究熱點(diǎn)。腸道作為機(jī)體重要的消化器官和免疫器官，腸道微生物通過菌群定殖等構(gòu)建了腸道微生態(tài)-黏膜免疫屏障[3?4]，主要表現(xiàn)在生物拮抗、黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)控以及控制代謝紊亂等方面。微生物菌群穩(wěn)定對宿主的能量平衡、腸道上皮健康、新陳代謝和免疫功能都有重要作用[5?6]。高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動物的胃腸道菌群特征分析，成為微生物群落多樣性研究中最常用的方法，用16S rRNA 基因測序技術(shù)分析口服發(fā)酵中藥前后腸道內(nèi)容物中腸道菌群的變化，可了解中藥對機(jī)體的腸道菌群組成造成的影響[7]，高效研究家禽腸道微生物的多樣性。

禽大腸桿菌病是由某些致病性血清型大腸桿菌引起的禽類不同疾病類型的總稱。選用常見的大腸桿菌血清型之一的O78[8]進(jìn)行人工感染建立發(fā)病模型，采用前期研發(fā)的發(fā)酵中藥[1]和硫酸新霉素進(jìn)行治療，分析該發(fā)酵中藥對白羽肉雞腸道結(jié)構(gòu)和腸道微生物菌群的影響，以期為該發(fā)酵中藥在臨床上治療禽大腸桿菌病提供參考，并為進(jìn)一步將其開發(fā)為高品質(zhì)藥用飼料添加劑提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

1 日齡供試愛拔益加（AA）白羽肉雞購自大連普灣新區(qū)炮臺齊泰隆種雞養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)于大連三儀動物藥品有限公司動物房。

1.2 試驗(yàn)材料

發(fā)酵中藥：將穿心蓮、白頭翁、黃連、黃柏、木香、敗醬草和甘草，按比例混合，60 ℃干燥，控制含水量為7%～13%，粉碎，混勻，浸泡4 h，水提2 次，每次90 min，提取液按一定比例添加益生菌種子液進(jìn)行液體深層發(fā)酵[1]，發(fā)酵液中有效活菌數(shù)達(dá)到1.0×108cfu/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硫酸新霉素可溶性粉為本公司自產(chǎn)產(chǎn)品。

雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗（新支剋星）：遼寧益康生物股份有限公司。

DNA抽提試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

參照文獻(xiàn)[9]的方法并結(jié)合NRC（1994）、《肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T33—2004）制定肉雞基礎(chǔ)飼糧。供試雞只采用復(fù)層式籠養(yǎng)，飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫均按《AA 肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進(jìn)行，每日觀察并記錄雞只健康狀況。整個飼養(yǎng)過程嚴(yán)格消毒，每天記錄環(huán)境變化情況及肉雞采食飲水和死亡情況。7日齡雞只采用滴鼻點(diǎn)眼接種傳染性支氣管炎和新城疫二聯(lián)疫苗，14日齡腿肌注射，利用7.0×107cfu/mL 大腸桿菌O78 造模，為避免應(yīng)激反應(yīng)，取消20 日齡法氏囊滅活苗的接種。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取1 日齡健康、體質(zhì)量相近的AA 肉雛雞300只，將其中270 只隨機(jī)分成3 組，每組3 個重復(fù)，分別為對照組（D 組）、抗生素組（K 組）、發(fā)酵中藥組（PEG 組），每個重復(fù)30 只；剩余30 只為造模對照組。飼養(yǎng)至14日齡，除對照組外，其余3組均用7.0×107cfu/mL大腸桿菌O78 以0.5 mL/只（半數(shù)致死量）建立發(fā)病模型；K組用成品藥硫酸新霉素0.075 g/羽+水0.5 mL，2次/d，口腔灌服，連服5 d治療；PEG組飼喂基礎(chǔ)飼糧，按1.0 g/mL 生藥量，0.5 mL/羽，2次/d，口腔灌服，連服5 d 治療；造模對照組不治療。試驗(yàn)期28 d。

1.5 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時，禁食12 h，每重復(fù)選取2 只接近平均體質(zhì)量的肉雞，D 組、K 組、PEG 組共取18 只雞剖檢。用事先滅菌的細(xì)線將盲腸結(jié)扎，剪下，于生物安全柜中取盲腸內(nèi)容物裝入無菌的5 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于腸道微生物菌群分析。

1.6 腸道微生物菌群分析

根據(jù)試劑盒說明書，對盲腸內(nèi)容物總DNA 進(jìn)行抽提。使用NanoDrop 2000檢測所抽提DNA 的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量。選擇16S rRNA 基因V3—V4 區(qū)引物338 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ ）和 806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）作為測序引物對盲腸內(nèi)容物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標(biāo)條帶，純化后備用。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫。

根據(jù)所擴(kuò)增的16S 區(qū)域特點(diǎn)，完成基因組DNA抽提后，設(shè)計(jì)合成引物接頭；根據(jù)測序區(qū)域合成帶有bracode 的特異引物，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；構(gòu)建小片段文庫，通過Illumina NovaSeq 測序得到原始數(shù)據(jù)。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類和物種分類分析，綜合運(yùn)用α 多樣性分析和β 多樣性分析等數(shù)據(jù)分析方法對各組肉雞的腸道菌群進(jìn)行多層面分析[10?11]。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行初步整理，應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因子方差分析（One?way ANOVA），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試肉雞造模后臨床表現(xiàn)

腿肌攻毒注射4 h 后，造模雞只開始出現(xiàn)精神沉郁、扎堆趴窩、羽毛凌亂。此時對K 組、PEG 組進(jìn)行試驗(yàn)治療，造模對照組繼續(xù)觀察。攻毒48 h 后，造模對照組雞只出現(xiàn)不同程度死亡，半數(shù)以上陸續(xù)開始采食，站立行動，但仍有趴臥現(xiàn)象。利用7.0×107cfu/mL大腸桿菌O78腿肌注射能夠成功造模，剖檢死亡和趴窩雞只，心臟、肝臟和脾臟器官出現(xiàn)不同程度的包心、包肝、脾臟腫大現(xiàn)象，用滅菌接種環(huán)取樣涂布于麥康凱培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基上均長出粉色大腸桿菌典型菌落，感染率100%（表1）。K 組和PEG 組治療24 h 雞只出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)在人進(jìn)入雞舍時雞只聽覺靈敏，扎堆趴窩現(xiàn)象消失；72 h雞只動作敏捷，飼喂時食欲旺盛，搶食搶水，羽毛光滑；試驗(yàn)結(jié)束剖檢，心臟、肝臟、脾臟均與D組無差別。

表1 大腸桿菌O78感染肉雞發(fā)病模型的建立Tab.1 Establishment of pathogenic model of E.coli O78 on broilers

2.2 肉雞腸道菌群的稀釋曲線

稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，當(dāng)曲線趨向平坦時，表明在當(dāng)前測序數(shù)據(jù)量下，樣本物種信息已基本被檢測到，增加測序深度不會產(chǎn)生更多的物種，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序有可能產(chǎn)生較多的OTU。通過稀釋曲線可以反映測序結(jié)果的合理性、準(zhǔn)確性以及樣本微生物多樣性的大小。如圖1 所示，D 組、K 組和PEG 組樣本在read<20 000 之前，OTU 數(shù)量隨著測序序列數(shù)的增加呈指數(shù)增長，而在read>20 000之后OTU數(shù)量增加速度明顯減緩，隨著測序量的增加逐漸趨于平緩。各樣本物種數(shù)量和多樣性指數(shù)并不會隨測序數(shù)量的增加而繼續(xù)增加，說明本研究所有樣本測序質(zhì)量較好，能夠覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種，數(shù)據(jù)量已基本合理，獲得的數(shù)據(jù)可以用于分析。

圖1 肉雞盲腸微生物的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of broiler cecum microbiota

2.3 發(fā)酵中藥對禽大腸桿菌病肉雞腸道菌群數(shù)量的影響

從圖2 可以看出，3 種不同顏色的圓對應(yīng)各組AA 肉雞盲腸所含的菌群，重疊部分為對應(yīng)組所共同含有的菌群。D 組有1 207 個OTU，K 組有1 173個OTU，PEG 組有1 205 個OTU，OTU 數(shù)量可以代表樣品物種的豐度，其中PEG 組與D 組物種豐度相當(dāng)，K 組物種豐度略低，但差異不顯著。3 組樣本共有875 個OTU，其中K 組與D 組共有945 個OTU，分別占K 組的80.56%，占D 組的78.29%；PEG 組與D組共有1 020 個OTU，分別占PEG 組的84.65%，占D組的84.50%。

圖2 不同處理組肉雞腸道菌群間OTU分布差異韋恩分析Fig.2 Venn diagram of OTU distribution difference in intestinal bacteria between broiler different groups

2.4 發(fā)酵中藥對禽大腸桿菌病肉雞盲腸微生物α多樣性的影響

各樣本在97%一致性閾值下，采用α 多樣性指數(shù)對樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性進(jìn)行比較分析，包括Simpson、Shannon、Chao 1和Ace 4個指數(shù)。其中Simpson、Shannon 指數(shù)用來評估菌群的多樣性，菌群的多樣性越高，Shannon 值越大，Simpson值越小。從表2可以看出，各組有效序列數(shù)均較高，在52 811～58 450，覆蓋度均為0.998，說明測序結(jié)果已經(jīng)基本覆蓋樣本的多樣性。D 組Shannon 指數(shù)最高，顯著高于K 組和PEG 組（P<0.05）。各組間Simpson、Chao 1、Ace 指數(shù)均無顯著性差異（P>0.05），說明經(jīng)過抗生素或發(fā)酵中藥治療后的患病雞只，盲腸內(nèi)微生物的物種總數(shù)、菌群豐度和多樣性趨近于對照組。

表2 發(fā)酵中藥對肉雞盲腸微生物α多樣性指數(shù)的影響Tab.2 Effects of fermented traditional Chinese medicine on α diversity index of cecum microbiota

2.5 發(fā)酵中藥對禽大腸桿菌病肉雞盲腸微生物β多樣性的影響

β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。本研究基于OTU 水平計(jì)算Unweighted Unifrac，采用無度量多維標(biāo)定法（NMDS）及β 多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。由圖3 可見，PEG 組樣本與D 組樣本相距較近，且組內(nèi)各樣本分布較密集，而K 組與D 組、PEG 組相距較遠(yuǎn)，組內(nèi)各樣本分布稀疏。以上結(jié)果表明，PEG 組和D 組樣本間多樣性差異較小，而K組與D組、PEG組樣本間多樣性差異較大。

圖3 發(fā)酵中藥對肉雞盲腸微生物β多樣性的影響Fig.3 Effects of fermented traditional Chinese medicine on β diversity of cecum microbiota

2.6 發(fā)酵中藥對禽大腸桿菌病肉雞盲腸微生物組成及其豐度的影響

2.6.1 門水平上的細(xì)菌組成 根據(jù)OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得每個樣本在門、綱、目、科、屬、種各分類水平的具體信息。AA 肉雞盲腸門水平微生物物種相對豐度前10 如圖4 所示，門水平上不同的處理組的優(yōu)勢菌群清晰可見。3個處理組盲腸門水平的優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬 桿 菌 門（Bacteroidota） 、 疣 微 菌 門（Verrucomicrobiota）、變形菌門（Proteobacteria）和未確定菌門（Unidentified_bacteria）。其余相對豐度小于1%的菌門分別為放線菌門（Actinobacteriota）、彎曲 桿 菌 門（Campilobacterota）、脫 硫 桿 菌 門（Desulfobacterota）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和協(xié)同菌門（Synergistota）。如表3所示，各組中厚壁菌門均為主要門，相對豐度在53.84%～58.27%；擬桿菌門相對豐度在25.80%～34.67%；疣微菌門相對豐度在1.57%～7.16%，PEG組顯著高于D組（P<0.05）。

表3 不同處理組優(yōu)勢菌的相對豐度（門水平）Tab.3 Relative abundance of dominant bacteria in different treatment groups（phylum level） %

圖4 肉雞盲腸微生物門水平組成Fig.4 Phylum level abundance of broiler cecum microbiota

2.6.2 屬水平上的細(xì)菌組成 在屬水平上，相對豐度大于1%的菌屬為優(yōu)勢菌屬。由圖5 和表4 可知，D 組肉雞盲腸菌群以糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）為主，感染大腸桿菌肉雞經(jīng)抗生素和發(fā)酵中藥治療后，肉雞盲腸細(xì)菌菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化。K組的糞桿菌屬相對豐度顯著高于D 組和PEG 組（P<0.05），其他菌屬與D組差異不顯著（P>0.05）；PEG 組Akkermansia、巴氏桿菌屬（Barnesiella）的相對豐度顯著高于D 組和K組（P<0.05），糞桿菌屬等其他菌屬與D 組差異不顯著（P>0.05）。Akkermansia具有抑制腸道疾病的作用[12]。由此可見，通過該發(fā)酵中藥對患病雞只的治療，改變了Akkermansia在盲腸中的分布，與D 組和K 組相比，PEG 組的盲腸內(nèi)容物Akkermansia屬細(xì)菌數(shù)分別增加了355%和272%，不僅能夠達(dá)到健康水平，在某種程度上還能夠提高其抑制腸道疾病的能力。

圖5 肉雞盲腸微生物屬水平組成Fig.5 Genus level abundance of broiler cecum microbiota

表4 不同處理組優(yōu)勢菌的相對豐度（屬水平）Tab.4 Relative abundance of dominant bacteria in different treatment groups（genus level） %

續(xù)表4 不同處理組優(yōu)勢菌的相對豐度（屬水平）Tab.4（Continued） Relative abundance of dominant bacteria in different treatment groups（genus level） %

2.7 肉雞腸道菌群功能預(yù)測

Tax4Fun 功能預(yù)測是通過提取KEGG 數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列，將測序樣品以SILVA 數(shù)據(jù)庫序列為參考序列進(jìn)行聚類，進(jìn)而獲取功能注釋信息。為驗(yàn)證不同處理對肉雞腸道菌群代謝能力影響的差異，根據(jù)細(xì)菌在數(shù)據(jù)庫中的功能注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從功能差異層面進(jìn)行聚類。結(jié)果如圖6所示，共獲取六大功能：人類疾病、有機(jī)體系統(tǒng)、新陳代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和環(huán)境信息處理。不同處理組的微生物功能各不相同，D 組在遺傳信息處理和環(huán)境信息處理方面的功能較豐富；K 組各類功能較為均衡；PEG組在人類疾病、有機(jī)體系統(tǒng)和新陳代謝方面的功能較為豐富，表明該發(fā)酵中藥可調(diào)節(jié)肉雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，提高有益菌群豐度，降低有害菌群豐度，調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸和代謝。

圖6 功能注釋相對豐度聚類分析Fig.6 Cluster analysis of the the relative abundance of functional annotation

3 結(jié)論與討論

腸道微生物菌群是肉雞消化吸收體系的一個重要組成部分，其菌群數(shù)量和種類隨動物所處的環(huán)境、飼料和健康狀況不同而差異很大。保持動物腸道微生物區(qū)系平衡，提高有益菌數(shù)量、降低有害菌數(shù)量對維持動物健康、提高動物腸道免疫機(jī)能非常重要[13]。

復(fù)方中諸藥合用理論上具有清熱解毒、燥濕止痢、行氣導(dǎo)滯、增強(qiáng)免疫力的功效[2]。黃連、黃柏的主要成分小檗堿不僅可以提高腸道內(nèi)門、屬級菌群的豐度和多樣性，改變腸道微生物菌群的組成，調(diào)控腸道菌群代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，還可以降低腸道通透性，維持腸道菌群穩(wěn)定，從而提高動物腸道功能[14]。白頭翁的主要成分皂苷及其腸道菌轉(zhuǎn)化成分可以提高益生菌、降低有害菌的菌群豐度，進(jìn)而通過改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)治療腸道疾病以及其他疾病[15]。

本研究中，發(fā)酵中藥不僅在表觀上能夠與硫酸新霉素有著相同的治愈率，在腸道菌群上，經(jīng)過抗生素或復(fù)方中藥治療后的患病雞只，盲腸內(nèi)微生物的物種總數(shù)、菌群豐度和多樣性趨近于對照組。

本研究中，發(fā)酵中藥對疣微菌門的影響主要體現(xiàn)在Akkermansia上。Akkermansia是一種腸道微生物，在腸道黏液層的生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，與腸道屏障功能有關(guān)[16]。LIU等[17]的研究結(jié)果也表明，蘆薈多糖干預(yù)后，結(jié)腸中短鏈脂肪酸（SCFA）及SCFA 產(chǎn)生屬Akkermansia和Blautia增加，小鼠結(jié)腸炎癥和屏障功能障礙明顯減輕。SCFA 是腸道菌利用益生元產(chǎn)生的一類有助于調(diào)節(jié)能量代謝和腸道穩(wěn)態(tài)的代謝物[18]。本研究中，發(fā)酵中藥組內(nèi)Akkermansia相對豐度顯著高于對照組和抗生素組，這可能是發(fā)酵中藥中的黃連、黃柏中含有小檗堿，能夠分解黏蛋白并刺激杯狀細(xì)胞合成黏蛋白達(dá)到動態(tài)平衡[19?20]，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。Akkermansia對腸道上皮細(xì)胞良好的黏附作用以及自聚集能力，有利于在腸道菌群中形成優(yōu)勢占位。大量研究表明，Akkermansia發(fā)揮益生功能的關(guān)鍵生理機(jī)制之一是基于其對宿主腸道屏障的調(diào)節(jié)，抑制腸道菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，進(jìn)而達(dá)到緩解機(jī)體慢性炎癥的作用[16，21]，使其成為維持腸道黏膜屏障的關(guān)鍵微生物。本研究因側(cè)重考察發(fā)酵中藥對肉雞腸道菌群方面的影響，試驗(yàn)期限28 d，下一步將延長試驗(yàn)期及進(jìn)行臨床試驗(yàn)，在肉雞出欄前測定其生長性能。

綜上，由穿心蓮、白頭翁、敗醬草、黃連等中藥制備的發(fā)酵中藥，可調(diào)節(jié)肉雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，提高有益菌群豐度，降低有害菌群豐度，調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸和代謝，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)健康，具有臨床推廣價值。