張 哲 吳巧燕 陳佳楠 徐 垚 計(jì)宏偉

(天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

應(yīng)用最廣泛的最佳方式的果蔬食材貯運(yùn)方式是低溫貯藏[1]，在此過程中，細(xì)胞組織溫度下降，細(xì)胞內(nèi)冰晶體出現(xiàn)、重結(jié)晶發(fā)生，進(jìn)而給果蔬組織細(xì)胞帶來損傷[2]，造成貯藏過程中品質(zhì)劣變，降低營養(yǎng)價(jià)值[3]。

國內(nèi)外很多研究人員針對(duì)低溫細(xì)胞損傷做出大量研究。Meryman等[4]研究冷凍復(fù)溫過程中對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)制，指明細(xì)胞外滲透壓會(huì)引起細(xì)胞變形，復(fù)溫過程現(xiàn)象與降溫過程逆過程類似，水分向外滲透對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。晏紹慶等[5]分析馬鈴薯在速凍下對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，指出速凍導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,降低了馬鈴薯片質(zhì)地。黎繼烈等[6]指出板栗凍結(jié)緩慢使得冰晶局部集中，造成細(xì)胞局部損傷。張哲等[7]研究葡萄冷凍—復(fù)溫過程發(fā)現(xiàn)，復(fù)溫速率越大，復(fù)溫后對(duì)細(xì)胞的損壞越大。Prestamo等[8]利用光學(xué)顯微鏡研究冷凍下細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的損傷。魯禮明等[9]研究草莓圣女果在不同冷凍下的形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞情況，表明冷凍速率越快，解凍后的蘋果圣女果形態(tài)結(jié)構(gòu)保存越好。劉斌等[10]和王鵬飛等[11]分別研究了不同速凍速率對(duì)洋蔥細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胡蘿卜細(xì)胞的影響。Bank[12]對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行快速冷卻，采用冷凍—壓裂技術(shù)觀測(cè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在遷移過程中酵母細(xì)胞從小冰晶體凝聚成重結(jié)晶。劉圣春等[13]研究不同降溫速率下蠶豆細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，慢凍比速凍細(xì)胞形態(tài)變化大。趙靜[14]研究表明加大冷凍速率，對(duì)葡萄細(xì)胞機(jī)械損傷小。吳錦鑄等[15]研究荔枝凍結(jié)規(guī)律以提高速凍荔枝商品質(zhì)量。王雅博等[16]研究得出冷卻速率越慢對(duì)洋蔥細(xì)胞內(nèi)表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成的機(jī)械損傷越大。

試驗(yàn)旨在從微觀方面研究在溫度載荷下果蔬細(xì)胞組織的損傷機(jī)理，利用低溫顯微鏡系統(tǒng)觀察降溫速率對(duì)細(xì)胞變形程度的影響以及細(xì)胞內(nèi)部的損傷演變過程，從形態(tài)學(xué)參數(shù)出發(fā)分析蘋果的損傷規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙臺(tái)蘋果：無損傷病害、大小一致、新鮮成熟，市售；低溫顯微鏡系統(tǒng)(如圖1所示)：配有用于信息采集、儲(chǔ)存的計(jì)算機(jī)，BX-43型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)DSC196型冷熱臺(tái)(英國林克曼科學(xué)儀器公司)，Linksys32溫度控制軟件。

1. CCD照相機(jī) 2. 目鏡 3. 物鏡 4. FDSC196型冷熱臺(tái) 5. 光源 6. 液氮罐 7. 冷熱臺(tái)溫度控制系統(tǒng) 8. 計(jì)算機(jī) 9. 主機(jī)圖1 低溫顯微鏡系統(tǒng)Figure 1 Cryogenic microscope system

1.2 方法

選取新鮮蘋果，剝?nèi)ネ獗砥ぃ瑢⑻O果果肉切成厚度在190～200 μm范圍內(nèi)，在氣密內(nèi)腔樣品室的冷熱臺(tái)中放置裝有果肉切片的載玻片，載玻片放置在高導(dǎo)熱的銀質(zhì)加熱元件上?？刂葡到y(tǒng)指令由Linksys32軟件設(shè)定發(fā)出，對(duì)腔體溫度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤并調(diào)整。溫度控制由液氮和電加熱絲同時(shí)作用，控溫偏差在±0.1 ℃/min，精確控制降溫、升溫速率和某一點(diǎn)溫度點(diǎn)的保持。設(shè)定降溫速率分別為1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min。液氮流量是根據(jù)所設(shè)定的降溫速率和蘋果樣品溫度，通過鉑金電阻的反饋計(jì)算液氮泵功率進(jìn)行調(diào)整，液氮泵將液氮壓縮后吹掃內(nèi)腔，調(diào)整螺桿控制樣品在X軸和Y軸移動(dòng)。對(duì)樣品進(jìn)行觀察分析時(shí)，使樣品正好投射到物鏡，可通過目鏡觀察，也利用顯微鏡上的高速攝像機(jī)將畫面投到計(jì)算機(jī)顯示器上，清晰觀察蘋果細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，記錄變化時(shí)的時(shí)間和溫度。采集的微觀細(xì)胞圖片用Image Pro-plus 6.0軟件進(jìn)行處理分析，軟件測(cè)量得到細(xì)胞的面積與周長(zhǎng)。

1.2.1 當(dāng)量直徑及圓度計(jì)算 由式(1)、式(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

d——當(dāng)量直徑，μm；

SR——細(xì)胞圓度；

A——細(xì)胞面積，μm2；

l——細(xì)胞周長(zhǎng)，μm。

1.2.2 細(xì)胞變形度計(jì)算 參照文獻(xiàn)[17]，由式(3)計(jì)算細(xì)胞變形度。

ε=γa-γb，

(3)

式中：

ε——細(xì)胞變形度；

γa——細(xì)胞降溫前長(zhǎng)短軸之比，μm；

γb——細(xì)胞降溫后長(zhǎng)短軸之比，μm。

1.2.3 體積及內(nèi)壓計(jì)算 由式(4)、式(5)計(jì)算：

(4)

(5)

式中：

V——體積，m3；

ΔP——內(nèi)壓，N/m2；

Δl——果蔬細(xì)胞周長(zhǎng)的變化量，m；

E——果蔬細(xì)胞壁彈性模量，取2.67×107N/m2；

R——變形后果蔬細(xì)胞的半徑，m；

h——果蔬細(xì)胞壁厚度，取1.26×10-6m；

γ——果蔬細(xì)胞壁的Possion比，取0.33。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果細(xì)胞的冷凍過程研究分析

圖2分別為以1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min的降溫速率利用低溫顯微鏡將蘋果細(xì)胞從室溫20 ℃降溫到-30 ℃的冷凍過程顯微圖。

由圖2(a)～圖2(e)可知，在1，2，5，8 ℃/min降溫速率下，蘋果細(xì)胞出現(xiàn)變形，體積變小。溶質(zhì)損傷和胞內(nèi)冰損失是損傷細(xì)胞的兩個(gè)主要因素[18]，細(xì)胞在比較低的降溫速率下會(huì)受到溶質(zhì)損失。慢凍下細(xì)胞間隙產(chǎn)生冰晶，冰晶生長(zhǎng)擠壓細(xì)胞使其變形，隨著冰晶的形成，細(xì)胞外部的溶液質(zhì)量摩爾濃度高于細(xì)胞內(nèi)部，從而細(xì)胞間隙產(chǎn)生高滲透壓。隨著時(shí)間的推進(jìn)，細(xì)胞內(nèi)水分通過細(xì)胞膜向外流失，導(dǎo)致細(xì)胞萎縮。但是未造成細(xì)胞破裂，這是因?yàn)槔w維素、半纖維素等微觀元素的存在，在植物細(xì)胞壁中起骨架支撐作用，賦予細(xì)胞壁優(yōu)異的韌性和抗拉強(qiáng)度[19]。由圖2(f)～圖2(h)可知，在10，15，20，50，90 ℃/min的5種降溫速率之下，組織細(xì)胞未大幅度變形，由于在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)同時(shí)達(dá)到結(jié)晶條件形成無數(shù)分布均勻小冰晶，平衡了壓力，蘋果細(xì)胞的外形特征仍有明顯差別，表現(xiàn)為擠壓細(xì)胞間隙，細(xì)胞擴(kuò)張。這與徐茂等[20]在快速凍結(jié)時(shí)對(duì)烤甘薯生理指標(biāo)的影響中的結(jié)論一致。

2.2 蘋果細(xì)胞的結(jié)晶時(shí)間和結(jié)冰溫度

在細(xì)胞不斷冷凍下，細(xì)胞內(nèi)部冰晶體的瞬間形成產(chǎn)生光的散射現(xiàn)象，導(dǎo)致顯微鏡視野變暗，觀察顯微圖像變暗的點(diǎn)，確定為蘋果細(xì)胞的結(jié)冰點(diǎn)。由圖2可知，蘋果細(xì)胞在由1 ℃/min降溫速率增大到90 ℃/min的降溫速率時(shí)，對(duì)應(yīng)凍結(jié)溫度由-16.833 ℃降低到-25.144 ℃，溫度降幅達(dá)到49.37%。由圖3可知，對(duì)應(yīng)結(jié)冰時(shí)間由2 078 s減少到54 s，持續(xù)時(shí)間也大大縮短。在較高降溫速率下的蘋果細(xì)胞的溫度載荷高于較低降溫速率下的載荷，蘋果細(xì)胞過冷度大，相變時(shí)間短，迅速形成大量細(xì)小的冰晶，釋放潛熱大。但是在較高降溫速率的降溫過程中，較大的溫度載荷使得細(xì)胞內(nèi)部水分無法及時(shí)滲透到細(xì)胞外部[21-22]。所以細(xì)胞內(nèi)水分暫未向外流動(dòng)就受到溫度載荷作用的影響，形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)械損傷。結(jié)冰溫度隨降溫速率的增加逐漸降低，結(jié)冰時(shí)間隨降溫速率增加而減小。在1 ℃/min到90 ℃/min降溫速率變化中，當(dāng)降溫速率<8 ℃/min時(shí)，結(jié)冰時(shí)間變化幅度大。而當(dāng)降溫速率>8 ℃/min時(shí)，結(jié)冰時(shí)間變化較小，見圖4。

圖2 蘋果組織細(xì)胞變化情況Figure 2 Changes of apple tissue cells

圖3 不同降溫速率下蘋果細(xì)胞的凍結(jié)時(shí)間與持續(xù)時(shí)間Figure 3 Freezing time and duration of apple cells at different cooling rates

圖4 結(jié)冰溫度Figure 4 Freezing temperature

2.3 蘋果細(xì)胞的一維形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

由圖5、圖6可知，蘋果細(xì)胞周長(zhǎng)變化量和當(dāng)量直徑隨降溫速率的增大呈先驟降后增大的趨勢(shì)。蘋果組織細(xì)胞在1 ℃/min的降溫速率下周長(zhǎng)變化量和當(dāng)量直徑變化量最大是11.9%，在90 ℃/min的降溫速率下周長(zhǎng)變化量最大是11.2%，變化均大于10%。由于水形成冰時(shí)體積要增大9%～10%，細(xì)胞必受到機(jī)械損傷[23]，當(dāng)冷卻速率比較小或者超級(jí)大時(shí)，蘋果細(xì)胞內(nèi)形成塊狀大冰晶，細(xì)胞變形度增大，細(xì)胞組織損傷嚴(yán)重，果蔬品質(zhì)降低。當(dāng)在2 ℃/min 到20 ℃/min降溫速率區(qū)間時(shí)，蘋果細(xì)胞變形度均小于4%，認(rèn)定組織細(xì)胞狀態(tài)較好，是因?yàn)橛屑?xì)胞壁的保護(hù)，果蔬細(xì)胞仍具有良好柔韌性。當(dāng)在低于2 ℃/min 和高于20 ℃/min降溫速率區(qū)間時(shí)，對(duì)細(xì)胞機(jī)械損傷較大，見圖5～圖7。

圖5 蘋果細(xì)胞周長(zhǎng)變化量Figure 5 Variation of cell perimeter in apple

圖6 蘋果細(xì)胞當(dāng)量直徑變化量Figure 6 Changes in the equivalent diameter of apple cells

圖7 蘋果細(xì)胞變形度Figure 7 Degree of cell deformation in apple

2.4 蘋果細(xì)胞的二維形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

由圖8可知，細(xì)胞面積變化量隨降溫速率的不斷增大先減小后增大。蘋果面積變化量最高37.69%是在降溫速率為90 ℃/min的降溫過程中，此時(shí)細(xì)胞損傷嚴(yán)重。蘋果面積變化量在10%以下說明細(xì)胞損傷小，由圖8可知，在2 ℃/min到20 ℃/min的降溫過程中，蘋果面積變化量<10%。由圖9 可知，在降溫速率比較低的情況下，蘋果細(xì)胞圓度變化呈波動(dòng)狀態(tài)，前后差距明顯。在高于20 ℃/min的降溫過程中，伴隨著降溫速率的增加，蘋果細(xì)胞圓度波動(dòng)變小，走勢(shì)愈加緩慢。

圖8 蘋果細(xì)胞面積變化量Figure 8 Change in cell area of apple

圖9 蘋果細(xì)胞圓度變化量Figure 9 Changes of apple cell roundness

2.5 蘋果細(xì)胞的三維形態(tài)學(xué)參數(shù)

細(xì)胞受均勻溫度載荷時(shí)，細(xì)胞形變和細(xì)胞內(nèi)壓的變化具有相關(guān)性[24]，由圖10可知，在90 ℃/min的降溫速率下，因?yàn)榻禍厮俾时容^高，水分快速凍結(jié)導(dǎo)致冰晶體的出現(xiàn)和生長(zhǎng)。由于水形成冰時(shí)體積會(huì)變成原來的1.1～1.2倍[25]，故體積變化大，變化量高達(dá)37.4%。由圖11可知，在1 ℃/min的降溫速率下，因?yàn)榫徛齼鼋Y(jié)，細(xì)胞在滲透壓作用下流失水分，冰晶持續(xù)長(zhǎng)大擠壓細(xì)胞間隙[26-27]，導(dǎo)致體積變化，體積變化量高達(dá)28%。結(jié)合圖10 和圖11可知，在10 ℃/min降溫速率處細(xì)胞體積變化量都達(dá)到最小狀態(tài)，僅為2.8%和1.69%。

圖10 蘋果細(xì)胞體積變化量Figure 10 Changes of cell volume in apple

圖11 蘋果細(xì)胞內(nèi)壓變化量Figure 11 Changes of intracellular pressure in apple cells

綜上，細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)變化量>10%的細(xì)胞損傷嚴(yán)重，故在9種不同降溫速率中舍棄使參數(shù)變化量在10%以上的降溫速率，得出10 ℃/min是其最佳降溫速率。

3 結(jié)論

對(duì)蘋果細(xì)胞在1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min的冷卻速率下進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀測(cè)，研究細(xì)胞損傷機(jī)理，得出以下結(jié)論：

(1) 在處理蘋果冷凍冷藏過程中引發(fā)的果蔬細(xì)胞損傷問題時(shí)，利用得到的蘋果細(xì)胞最佳降溫速率，可以更好地避免溫度載荷造成的細(xì)胞損傷，盡量減少蘋果干耗問題，提高蘋果的實(shí)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。

(2) 蘋果細(xì)胞的結(jié)冰溫度隨冷凍速率的增加而降低，凍結(jié)時(shí)間也大大縮短。在1 ℃/min到90 ℃/min的降溫區(qū)間中，溫度降幅達(dá)49.37%，而對(duì)應(yīng)的結(jié)冰時(shí)間僅為原來的1.7%。

(3) 隨著降溫速率的不斷增大，蘋果細(xì)胞周長(zhǎng)、面積和體積均是先減小后增大的趨勢(shì)。細(xì)胞內(nèi)壓隨細(xì)胞體積而變化。

(4) 最好在貯運(yùn)過程將降溫度速率控制在10～20 ℃/min。