侯博玉 萬金慶,2,3 徐 鳴 王友君 孫曉琳 童 年

(1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3. 農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；4. 安徽宜康高新農業(yè)科技有限公司，安徽 六安 237200)

魚糜是一種魚肌纖維蛋白的聚合物，具有許多優(yōu)良的特性，包括出色的凝膠能力、風味可塑性(可混合多種調味品)，以及形成凝膠后的美學特性(外觀、質地和顏色)[1]。目前，魚糜貯藏方式主要為冷藏或者冷凍，冷藏魚糜產品的貨架期較短，通常貯藏兩周左右就會腐敗變質，且運輸和貯藏成本較高；而冷凍會導致魚糜凝膠變差，因為冷凍會引起肌肉纖維蛋白部分變性[2-3]。冰溫貯藏是將食品貯藏在0 ℃以下至物品凍結點以上的貯藏技術，該技術可以避免因冷凍對食品造成的損害并延長保質期。但是冰溫貯藏技術的實施需要精確的溫度控制，而商業(yè)冷庫的控溫精度在±1 ℃以上，無法達到生鮮食品冰溫貯藏的技術要求[4]。魚糜制品冰點較低且具有較大范圍的冰溫帶，以現有的設備完全可以將冰溫技術應用在魚糜制品保鮮中。

生物胺(BAs)是非揮發(fā)性的含氮有機化合物，存在于富含游離氨基酸(FAA)和蛋白質成分的食物中，在發(fā)酵的肉制品和水產品中最為常見[5]。從膳食中攝入過多的胺類物質會對人體健康產生毒害作用[6]。因此，研究冰溫貯藏過程中生物胺的變化，可以更加深入地了解冰溫貯藏對魚糜的質量影響。

影響水產品質量的另一個重要因素是水分，水分與微生物生長繁殖有關，會影響產品的穩(wěn)定性和保質期。此外，水分還會影響水產品肉制品的感官質量以及多汁性[7]。適當降低魚糜制品中的水分，可以使魚糜獲得更好的質構特性。冰溫脫水技術可以脫去新鮮物料中的部分水分并最大限度保持其新鮮度，同時還可以降低物料冰點，避免冰溫過程中食品形成冰晶破壞凝膠品質，降低對冰溫設備的溫控要求，有利于冰溫技術的推廣應用。研究擬通過冰溫脫水與冰溫貯藏相結合的方式，探究黑魚香腸在冰溫貯藏過程中的品質變化，以期為冰溫技術在魚糜制品貯藏中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黑魚：上海臨港新城農工商超市；

生物胺標準品：上海生工公司；

衍生試劑丹磺酰氯(DNS-Cl)、乙腈(色譜純)、乙醚(分析純)、丙酮(分析純)、氨水(分析純，質量分數25%)：上海泰坦科技股份公司；

平板計數瓊脂：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈臺：VS-1300-SU型，江蘇凈安泰集團;

恒溫恒濕箱：LHS-150HC型，上海一恒科學儀器有限公司;

凱氏定氮儀：Kjeltec 2300型，丹麥福斯公司;

高速冷凍離心機：H-2050R-1型，湘儀離心機有限公司;

紐邁臺式脈沖核磁共振分析儀：PQ 001型，美國Waters公司；

高效液相色譜儀：Waters 2659型，美國Waters公司；

掃描電子顯微鏡：SU-5000型，日本日立公司；

質構分析儀：TA-XT2i型，英國STABLE MI-CR-OSYSTEMS公司；

溫度采集儀：Agilent-34972A型，美國安捷倫公司；

色差儀：CR-400型，日本本可尼卡美能達公司。

冰溫真空干燥機(見圖1)：自行研制。

1. 冷阱制冷機組 2. 真空壓力變送器 3. 手閥 4. 放氣閥 5. 電動蝶閥 6. 止油閥 7. 真空泵 8. 漏氣閥 9. 物料 10. 托盤 11. 電加熱板 12. 質量傳感器 13. 真空箱 14. 排水閥 15. 冷阱圖1 冰溫真空干燥機原理圖Figure 1 Principle diagram of freezing temperature vacuum dryer

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 取新鮮魚肉500 g于絞肉器中攪拌5 min后，按質量分數依次加入2%食鹽、3%白砂糖、1%料酒、4%玉米淀粉和10%冰水，繼續(xù)攪拌5 min至魚糜均勻成糊狀。將攪拌后的魚糜用灌腸器灌裝于聚乙烯腸衣中。灌裝好的香腸在40 ℃下蒸煮30 min，隨后在90 ℃ 下蒸煮20 min，冷卻至室溫。將冷卻后的香腸置于冰溫脫水干燥機中，脫水7 h，香腸水分含量由70%降至50%。

1.3.2 貯藏試驗 香腸脫水后真空包裝一部分放置在(4±1) ℃的冰箱為冷藏組，另外一部分放置在(-4±0.5) ℃ 的恒溫恒濕箱中為冰溫組。每7 d從每組魚腸中隨機抽取3個樣品進行低場核磁共振分析。

1.3.3 冰點溫度測定 使用Agilent 34972A型數據采集儀和熱電偶對黑魚香腸進行冰點測定。

1.3.4 菌落總數(TVC)測定 按GB 4789.2—2016執(zhí)行。

1.3.5 pH值測定 按GB 5009.237—2016執(zhí)行。

1.3.6 總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測定 按GB 5009.228—2016執(zhí)行。

1.3.7 硫代巴比妥酸值(TBA)測定 根據Yang等[6]的方法，修改如下：稱取3.0 g魚肉香腸放置于50 mL離心管中，加入5倍魚肉體積的三氯乙酸(體積分數20%)。玻璃棒攪拌混合后使用均質機均質，靜置1 h，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。取5 mL溶液與0.02 mol/L TBA溶液，搖勻，沸水浴20 min后冷卻，測定532 nm處光密度(D)值。以丙二醛的質量分數表示TBA值，單位為mg/kg。

1.3.8 香腸的持水能力(WHC) 根據Priyadarshini等[8]的方法，修改如下：將樣品切成厚度為4 mm的薄片，準確稱重(ml)，然后用3層濾紙包裹。在4 ℃下離心10 min(6 000 r/min)，然后再次快速稱重m2。按式(1)計算香腸的持水率。

(1)

式中：

WHC——香腸持水率，%；

m1——離心前香腸質量，g；

m2——離心后香腸質量，g。

1.3.9 顏色 將香腸切成約0.5 cm厚的薄片，用CR-400型色差儀測定魚糜膠的L*(亮度)、a*(紅度)和b*(黃度)。按式(2)計算香腸白度值。

(2)

式中：

White——香腸的白度值；

L*——香腸的亮度值；

a*——香腸的紅度值；

b*——香腸的黃度值。

1.3.10 香腸的質構分析(TPA) 將香腸樣品切成5 mm厚的圓柱體，用質譜儀分析香腸紋理。TA.XT Plus質譜儀的傳感器型號為P/50底層平柱探針，以1 mm/s的變形率壓縮到20%的高度，循環(huán)2次，衰減率為1 mm/s，起始力2.5 N；延遲5 s，速率最高為1 mm/s。

1.3.11 香腸微觀結構 參考王嵬等[9]的方法，修改如下：將魚肉香腸切割成形狀規(guī)則的正方體(2 mm×2 mm×2 mm)，2.5%戊二醛溶液固定2 h，用體積分數為30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇進行梯度洗脫，洗脫的時間間隔為15 min。冷凍干燥，離子濺射鍍金，然后用掃描電鏡觀察，電壓設置為5 kV。

1.3.12 低場核磁共振(LF-NMR)與核磁成像(MRI)分析 參照熊澤語等[10]的方法。取15 g樣品切成大小相近的圓柱體，用保鮮膜包好放入核磁管中，采用自旋回訊磁振脈中序列測定。測定參數：質子共振頻率21 MHz， 射頻延時0.002 ms， 模擬增益20.0 dB，90°脈寬19 μs，累加次數8，180°脈寬38.0 μs，延時1.000 ms，回波個數1 000，每組3個平行。

1.3.13 生物胺(BAs)含量測定 參照Huang等[7]的方法，修改如下：將3 g香腸用20 mL 0.4 mol/L高氯酸以10 000 r/s的速度均質1 min，并在4 ℃、4 500 r/min條件下離心10 min。收集上清液，該過程重復2次。上清液通過有機相膜注射器過濾器(13 mm，0.22 μm)過濾，用0.4 mol/L 高氯酸將濾液的最終體積調整到50 mL。用DNS-Cl進行衍生化反應。使用高效液相色譜進行分離，采用Symmetry C18柱(柱長250 mm，柱內徑4.6 mm)，二極管陣列檢測器，254 nm。使用水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)梯度洗脫。洗脫程序為：0 min，35% A+65% B；5 min，30% A+70% B；20 min，0% A+100% B；25 min，35% A+65% B。

1.3.14 數據處理 采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，顯著差異水平取P<0.05， 用Origin 9.1軟件繪圖。所有試驗均重復3次，數據表示為平均值±標準差。

2 結果和討論

2.1 冰點溫度測定

圖2顯示了脫水前后香腸冰點的變化。脫水前的冰點為(-4.0±0.2) ℃，脫水后的冰點為(-5.6±0.2) ℃。脫水后香腸的冰溫帶為(-5.6～0) ℃。為實現脫水后的香腸在冰溫帶內貯藏，且恒溫恒濕箱在-4 ℃溫度波動最小，選擇(-4.0±0.5) ℃作為接近冰點的貯藏溫度。

圖2 香腸脫水前后冰點的變化Figure 2 Changes in freezing point of sausage before and after dehydration

2.2 pH值的變化

由圖3可知，黑魚香腸的初始pH值約為6.88，隨著貯藏時間的增加，冷藏組的pH在第14天達到最低值6.65(P<0.05)。在貯藏期結束時，冷藏組的pH值上升到6.79。冰溫組的pH變化趨勢和冷藏組相同，但時間滯后，冰溫組在第28天達到最低值6.67(P<0.05)。魚香腸中pH值下降可能是由于乳酸菌產生了乳酸。貯藏后期魚腸中蛋白質降解成肽、氨基酸和胺類物質，導致樣品pH值上升[11]。

圖3 香腸貯藏期間pH值變化Figure 3 The pH value change of sausage during storage

2.3 TVC值的變化

由圖4可知，貯藏第0天時TVC的值為(2.06±0.05) lg(CFU/g)，樣品質量良好。冷藏組在第21天時，TVC值[(5.37±0.06) lg(CFU/g)]明顯上升。根據GB 2726—2016《食品安全國家標準 熟肉制品》中菌落總數最高安全限量為5 lg(CFU/g)，因此判斷冷藏21 d的黑魚香腸菌落總數超過安全極值，冰溫貯藏42 d時TVC值達到(5.23±0.15) lg(CFU/g) 超過安全限量。結果表明，與冰溫貯藏相比，冷藏樣品的細菌生長速率更快。真空條件以及低溫貯藏環(huán)境會抑制大多數細菌的生長和繁殖。在冷藏溫度下真空包裝乳化香腸的主要腐敗細菌是乳酸菌，而溫度對真空包裝中乳酸菌的生長有很大限制[12-13]。因此，冰溫貯藏能夠對真空包裝的香腸中的細菌生長起到很好的抑制作用。

圖4 香腸貯藏期間TVC值變化Figure 4 The change of TVC value of sausage during storage

2.4 TVB-N值的變化

由圖5可知，在冷藏組和冰溫組貯藏期間TVB-N值呈上升趨勢，冰溫組的TVB-N值明顯低于冷藏組(P<0.05)。此外，冷藏組貯藏21 d后樣品的TVB-N值(19.63 mg/100 g)高于冰溫貯藏的(17 mg/100 g)，參考GB 2733—2015，樣品TVB-N值已經達到淡水產品的最高限量20 mg/100 g，說明冷藏組樣品在第21天已達到貯藏末期，與Liu等[14]一致。TVB-N值的增加主要是由于內源酶和腐敗菌對蛋白質的降解[15]。

圖5 香腸貯藏期間TVB-N值的變化Figure 5 The change of TVB-N value during sausage storage

2.5 TBA值的變化

香腸的氧化變化對于評估其質量和保質期非常重要，測定丙二醛含量是一種比較同類型樣品的不同氧化程度較合適的方法[16]。圖6顯示了黑魚香腸在冰溫和冷藏期間丙二醛含量的變化。兩組的TBA初始值為(0.25±0.01) mg/kg香腸，貯藏末期冰溫和冷藏香腸的丙二醛含量隨著貯藏期的延長分別增加到(0.73±0.01)，(0.76±0.01) mg/kg。兩者在貯藏期間有顯著差異(P<0.05)。根據研究結果，冰溫能夠抑制黑魚香腸的脂肪氧化。

圖6 香腸貯藏期間TBA值的變化Figure 6 Changes in TBA values of sausage during storage

2.6 WHC的變化

由圖7可知，貯藏溫度對黑魚香腸的WHC有明顯影響。隨著貯藏時間的增加，樣品的WHC呈下降趨勢(P<0.05)，這可能是由于蛋白質的凝膠網絡被破壞以及凝膠網絡在長時間貯藏期間保留水分的能力下降。在相同貯藏期間，冰溫貯藏香腸的WHC明顯高于冷藏組香腸的(P<0.05)。

圖7 香腸貯藏期間WHC的變化Figure 7 WHC changes of sausage during storage

2.7 香腸顏色的變化

由表1可知，香腸的顏色在冰溫和冷貯藏存期間均有相同的變化趨勢。L*值隨著貯藏時間的增加而明顯下降，在貯藏末期最為明顯(P<0.05)。a*值在貯藏期間無太大變化，而b*值隨著貯藏時間的增加而增加(P<0.05)。貯藏期間冷藏組的亮度和白度低于冰溫組樣品。這一結果與Fuentes等[17]的研究一致。

表1顯示香腸的a*值無明顯變化，主要原因可能是冷藏與冰溫貯藏并未對香腸中的肌紅蛋白含量造成顯著影響。肌紅蛋白的含量是影響a*值的主要因素[18]。香腸的色澤發(fā)生變化通常是因為脂肪和蛋白質氧化，蛋白質的氧化也會受到貯藏溫度的影響，較高的貯藏溫度會加速蛋白質的氧化[19]。因此，冰溫貯藏對魚腸的顏色保持有一定作用。

2.8 香腸的質地

由圖8可知，香腸的硬度、咀嚼性和膠黏性在貯藏過程中呈下降趨勢(P<0.05)，而香腸的黏結性和彈性無明顯變化(P>0.05)。前28 d，所有組別香腸樣品的硬度、膠黏性和咀嚼性均有不同程度下降。結果表明，香腸的質地在貯藏期間變軟，這可能是由于肌肉蛋白酶和組織蛋白酶以及微生物(細菌和酵母)蛋白酶促進了蛋白質的水解[20]。黃業(yè)傳等[21]研究4 ℃與25 ℃的貯藏環(huán)境對香腸質構特性的影響，結果表明溫度越高，腸體越松軟。綜上，冰溫組比冷藏組有更高的質地指數。一方面是由于冰溫貯藏環(huán)境對細菌活性的抑制作用，以及與冷藏相比，冰溫組樣品有更好的持水能力，另一個方面可能是冰溫降低了酶的活性，減緩了蛋白質的降解程度[22]。

圖8 黑魚香腸的硬度、咀嚼性、膠黏性、黏結性和彈性的變化Figure 8 Changes in the hardness, chewiness, gumminess, cohesiveness，and springiness of snakehead sausages

2.9 香腸的微觀結構

樣品微觀結構圖(見圖9)中蜂窩狀的中間空隙顆粒為脂肪顆粒[23]。由圖9可知，隨著貯藏時間增加，冷藏條件下的魚香腸凝膠網絡上空隙逐漸增加，脂肪顆粒逐漸減少，造成這種結果可能是樣品凝膠網絡對脂肪顆粒的約束力減小。只有當凝膠結構較差(大孔或空隙)，水可以自由流動時，脂肪才能離開基質[24]。隨著貯藏時間的推移，香腸中自由水的數量增加，大大降低了凝膠網絡對脂肪的結合力。香腸凝膠網絡中的脂肪顆粒對香腸的質地影響較大，因為脂肪顆粒提供了良好的硬度和咀嚼性[25]。由于凝膠網絡對脂肪顆粒的結合力下降，導致脂肪流動性增加，脂肪更容易被氧化和降解，從而影響香腸的質地特性。從圖9(e)可以看出，冰溫貯藏的香腸的空洞數量較少。綜上，冰溫貯藏的香腸對脂肪顆粒的結合能力要優(yōu)于冷藏。

圖9 黑魚香腸在冰溫和冷藏條件下的 SEM顯微圖Figure 9 SEM micrographs of snakehead sausage at day 0 (a), day 21 (b), day 42 (c) during frozen storage and at day 0 (d), day 14 (e), day 21 (f) during refrigerated storage

2.10 低場核磁共振(LF-NMR)和核磁成像(MRI)

圖10顯示了冷藏和冰溫的黑魚香腸的松弛時間T2的變化情況。分布圖顯示香腸含有3種狀態(tài)的水：結合圖11顯示的核磁共振圖像紅色對應的是高質子密度區(qū)域，藍色表示低質子密度區(qū)域。黑魚香腸蛋白質降解隨著時間延長而增加，蛋白質網絡中水分減少，紅色區(qū)域開始減少，藍色區(qū)域開始增加。冷藏組在第21天的藍水T21(0～10 ms)，與大分子和蛋白質緊密結合，變化不大；不易流動水T22(10～150 ms)；自由水相T23(150～1 500 ms)，分布在在肌原纖維之外[26]。隨著貯藏時間的增加，T22的振幅開始下降，從長弛豫時間轉向短弛豫時間，這一趨勢在冷藏組更明顯。黑魚香腸中的蛋白質以及凝膠網絡被細菌或酶破壞，脂肪和蛋白質的氧化同樣也會破壞蛋白質網絡結構[5]。另外，隨著蛋白質凝膠網絡強度的降低，部分結合水變成自由水，導致T22減少。

圖10 冰溫和冷藏條件下黑魚香腸的橫向弛豫時間T2反演圖Figure 10 Inversion spectrum of transverse relaxation time T2 of sausage during frozen storage and refrigerated storage

圖11 冰溫貯藏和冷藏條件下香腸的偽彩圖Figure 11 False-color image of the water proton density in sausage during frozen storage and refrigerated storage

色圖像[圖11(d)]比冰溫組第42天[圖11(i)]的變得更藍更暗，表明黑魚腸的含水量在減少。這種現象是由蛋白質網絡降解后水分流失速度加快造成的。因此，水分分布對黑魚香腸的質量有重要影響，且與香腸中蛋白質變性及凝膠網絡結構的變化有關。

2.11 生物胺的變化

在香腸中發(fā)現了5種BAs：色胺、腐胺、酪胺、尸胺和組胺。由表2可知，冰溫貯藏能有效減少香腸中BAs的形成，因為冰溫減緩了微生物的生長，且真空包裝抑制了一些好氧菌的生長和繁殖，包括一些BAs陽性菌，從而減少了BAs的形成[27]。由圖12可知，貯藏期間，香腸中的色胺冷藏組明顯高于冰溫組[圖12(a)]，冰溫組和冷藏組腐胺的變化從初始值(10.5±0.4) mg/kg到貯藏第21天的17.18 mg/kg和15.76 mg/kg[圖12(b)],所有樣品中的酪胺含量在整個貯藏過程中以不同的速度增加[圖12(c)]，尸胺從(71.76±0.2) mg/kg分別增加到(74.25±0.29),(76.4±0.1) mg/kg[圖12(d)]，冷藏組和冰溫組的組胺含量從第0天的60.55 mg/kg到貯藏末期分別增加到66.88,65.42 mg/kg[圖12(e)]。冷藏組比冰溫組中生物胺的含量增加速度更快，表明較低的貯藏溫度可以抑制生物胺的形成。此外，除色胺外在香腸貯藏過程中的酪胺、組胺、腐胺和尸胺變化趨勢與Li等[28]的研究一致，其原因可能是魚的種類不同。

表2 香腸中的5種生物胺的總濃度Table 2 Total concentrations of the five kinds of biogenic amines mg/kg

圖12 黑魚香腸中5種生物胺的含量變化Figure 12 Content variation of the five kinds of biogenic amines in snakehead sausage

3 結論

通過對菌落總數、總揮發(fā)性鹽基氮值、生物胺含量、香腸持水能力等指標的測定，并結合LF-NMR與MRI對香腸水分分布及微觀結構的分析可知，冰溫貯藏可延緩黑魚香腸流通期間的品質劣變。與冷藏組相比，冰溫組貯藏過程中總揮發(fā)性鹽基氮、總活菌數、香腸持水能力值均較低，此外，冰溫貯藏還能夠抑制因脂肪和蛋白質氧化引起的色澤變化并保持樣品香腸質構特性。根據生物胺含量變化分析，香腸貯藏過程中色胺含量變化最明顯，相同貯藏時間內，冰溫貯藏組生物胺總量比冷藏組少。結合菌落總數和總揮發(fā)性鹽基氮指標綜合分析得出冰溫貯藏黑魚香腸的保質期大致在42 d，比冷藏的保質期(21 d)延長了大約1倍。此外，冷藏期間香腸微觀結構受破壞嚴重，產生大量孔隙，導致其對水分的束縛能力減弱，不易流動水的含量大幅降低。而冰溫貯藏的質構變化較小。綜上所述，冰溫貯藏具有較好的持水能力，能夠很大程度保持黑魚香腸的品質，并延長貯藏期。該研究結果為冰溫貯藏技術更好的應用于水產品貯藏保鮮提供了理論參考。