朱巧艷，李叢叢，肖亞朋，賈然潔，高彬文，趙坤坤，張盼濤*

（1. 洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000；2. 北京中科基因技術(shù)股份有限公司，北京 102600）

我國是世界上養(yǎng)禽大國，疫病的發(fā)生與流行是制約我國家禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，同時對食品安全、生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害?？茖W(xué)有效地防控畜禽疫病是我國養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大需求。2022年上半年洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司對我國主要家禽養(yǎng)殖地區(qū)送檢樣品進(jìn)行疫病的檢測診斷或感染狀態(tài)監(jiān)測，對檢測結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析。該檢測結(jié)果對我國家禽疫病流行趨勢分析、疫病防控策略的制定提供臨床數(shù)據(jù)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料與試驗(yàn)動物

2022年1～6月，洛陽中科基因檢測的雞、鴨、鵝組織病料樣品主要來自于遼寧、山東、河南、河北、江蘇、湖北、山西、江西、廣東和廣西等主要家禽養(yǎng)殖地區(qū)。

SPF雞種蛋購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，由洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司孵化至適宜日齡用于H9亞型AIV、IBV和IBDV的分離。

1.2 主要試劑和引物

磁珠法核酸提取試劑盒，購自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司；PCR和RT-PCR相關(guān)試劑購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；引物合成和基因測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究中使用的PCR和RT-PCR鑒定引物，以及病原目的基因擴(kuò)增引物，由洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司參考世界動物衛(wèi)生組織、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)、中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合成、保存。

1.3 病料處理與分子鑒定

針對病毒性疫病，根據(jù)檢測項(xiàng)目選取對應(yīng)的組織，按文獻(xiàn)報道的方法將組織剪碎后研磨成勻漿，按照1:5的比例加入含雙抗（青霉素 10 000 U/mL、鏈霉素2 000 U/mL）的滅菌PBS，-20 ℃反復(fù)凍融3次后置于4 ℃作用4 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20 ℃保存[1]。取200μL上清液，按照磁珠法核酸提取試劑盒說明書，利用全自動核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。對提取后的核酸按照洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司建立的方法，對病料樣品進(jìn)行病原分子鑒定。

1.4 病毒分離與遺傳進(jìn)化分析

對1.3中分子鑒定為陽性的H9亞型AIV、IBV、IBDV病料研磨離心獲得的上清液接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。H9亞型AIV和IBV病毒分離時，按文獻(xiàn)報道的方法將上清液按照0.2 mL/枚的劑量，尿囊腔途徑接種9～11日齡的SPF雞胚，置于37 ℃孵化箱孵育觀察至120 h，收獲接種后24～120 h死亡雞胚及120 h存活雞胚的尿囊液[1-2]。IBDV病毒分離時，接種途徑為雞胚絨毛尿囊膜，接種后棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收獲接種后24～120h死亡雞胚及120 h存活雞胚的尿囊液、絨毛尿囊膜，-20 ℃反復(fù)凍融3次后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液[3]。

對分離的H9亞型AIV、IBV和IBDV病毒按前述方法提取核酸，分別擴(kuò)增HA基因全長、S1基因、VP2基因，RT-PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，使用Lasergene軟件對測序結(jié)果進(jìn)行處理和編輯。根據(jù)GenBank上發(fā)表的相關(guān)毒株序列，使用Mega 6.0軟件分別對HA基因、S1基因、VP2基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.5 細(xì)菌分離與鑒定

針對分離的不同致病菌采集對應(yīng)的樣品，按常規(guī)無菌操作劃線接種于TSA和麥康凱平板，5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察形態(tài)[4]。形態(tài)學(xué)無法確定細(xì)菌種、屬時，進(jìn)一步通過生化鑒定或16s基因測序進(jìn)行確定。

1.6 腫瘤性疾病的病理組織學(xué)觀察

針對腫瘤性疾病，結(jié)合臨床癥狀選擇對應(yīng)的組織臟器，按照常規(guī)方法進(jìn)行取材固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片烤片、脫蠟染色等步驟進(jìn)行HE染色、觀察，確定腫瘤性疾病的種類[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞病毒病檢測結(jié)果

2022年1～6月共檢測送檢的雞病料6 087份，開展H9亞型AIV、IBV等17種病原的檢測。送檢樣品中，檢測樣品數(shù)量最多的病原分別為雞白血?。ˋLV）、H9亞型AIV、IBV、雞新城疫病毒（NDV）、I群禽腺病毒（FAdV-I）和雞傳染性貧血病毒（CIAV），而檢出率最高的病原分別為IBV、雞馬立克氏病病毒（MDV）、IBDV、H9亞型AIV、CIAV、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV），陽性率分別為41.03%、39.08%、25.00%、20.36%、20.31%、18.29%。FAdV-I、禽呼腸孤病毒（ARV）、REV雖有一定的送檢量，但檢測陽性率均小于10%。而禽腦脊髓炎病毒（AEV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）、雞痘病毒（FPV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）2022年上半年送檢量較少，并且檢測均為陰性。上述檢測結(jié)果表明，由IBV、H9亞型AIV、ILTV引起的呼吸道疫病和由CIAV和IBDV引起的免疫抑制病依然是目前雞群疫病防控的重點(diǎn)和難點(diǎn)。MDV檢測的陽性率高達(dá)39.08%，結(jié)合樣品背景和陽性樣品Meq基因測序結(jié)果，這些陽性樣品中26/34（76.47%）為疫苗株，說明目前臨床中使用的MDV相關(guān)活疫苗整體防控效果較為理想。

另外，樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，禽偏肺病毒（aMPV）和禽戊型肝炎病毒（aHEV）雖有一定的送檢量，但均未檢出。該檢測結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道的高抗體陽性率不一致[6，7]。分析原因，可能是aMPV和aHEV單獨(dú)感染引起的癥狀較輕微，需要與其它病原混合感染才能表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，此時采樣檢不出或檢出率極低[8-10]。針對這兩種疫病，目前沒有商品化的疫苗可以使用，應(yīng)做好生物安全防控。 2022年上半年雞病毒檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 2022年上半年雞病毒檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 H9亞型AIV、IBV和IBDV遺傳進(jìn)化分析

對2022年上半年分離的H9亞型AIV、IBV、IBDV進(jìn)行測序，測序的靶基因分別為HA基因、S1基因、VP2基因，根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

對55株H9亞型AIV的HA基因進(jìn)行測序，HA基因核苷酸遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，55/55均屬于歐亞譜系的h9.4.2.5分支，其中54/55屬于9.4.2.5a分支毒株，1/55屬于9.4.2.5b分支毒株，表明9.4.2.5分支毒株為目前臨床優(yōu)勢流行毒株，與文獻(xiàn)報道一致[11-12]。分離株遺傳進(jìn)化分析見圖1。55株分離株之間的同源性為91.5%～100%，而與國內(nèi)常用的疫苗株SS株和F株之間的同源性均較低，僅為86.7%～89%，核苷酸的突變會導(dǎo)致氨基酸的變化，表明現(xiàn)有疫苗對雞群的免疫保護(hù)效果有限，在持續(xù)的免疫壓力下，促使H9亞型AIV病毒不斷的發(fā)生變異。

圖1 2022年上半年H9亞型AIV分離株HA基因遺傳進(jìn)化分析（三角標(biāo)記為本研究分離毒株）

對41株IBV的S1基因進(jìn)行測序，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，29/41屬于QX-Like分支毒株，6/41屬 于4/91-Like分 支 毒 株，4/41屬 于Mass-Like分支毒株，1/41屬于TW Ⅰ型分支毒株，1/41屬于基因Ⅵ型分支毒株，QX型IBV依然是優(yōu)勢流行分支，其次為4/91-Like和Mass-Like型分支毒株，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道基本一致[13]。分離株遺傳進(jìn)化分析見圖2。臨床中多種IBV基因型共同流行，商品化的活疫苗也有多種，但I(xiàn)BV基因型之間交叉保護(hù)效果有限，個別基因型活疫苗存在安全性隱患，使用時應(yīng)慎重。針對IBV的防控，臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)表明，采用安全性好的IBV活疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，利用滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的策略可取得良好的免疫效果。

圖2 2022年上半年IBV分離株S1基因遺傳進(jìn)化分析（三角標(biāo)記為本研究分離毒株）

對分離的14株IBDV VP2基因進(jìn)行測序，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，12/14屬于變異株，2/14屬于超強(qiáng)毒株[14]，分離株遺傳進(jìn)化分析見圖3。針對IBDV的防控，目前有商品化的全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、重組病毒活載體疫苗、致弱活疫苗和抗原抗體復(fù)合物，從臨床應(yīng)用效果來看，這些疫苗對超強(qiáng)毒株和經(jīng)典株的防控效果較為理想，但是針對變異株并未能提供有效保護(hù)，建議養(yǎng)殖企業(yè)選用針對變異株保護(hù)效果更佳的疫苗。

圖3 2022年上半年IBDV分離株VP2基因遺傳進(jìn)化分析（三角標(biāo)記為本研究分離毒株）

2.3 水禽病毒病檢測結(jié)果

2022年1～6月本實(shí)驗(yàn)室共檢測送檢的水禽病料262份，開展鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）等8種病原的檢測。送檢樣品中，檢測樣品數(shù)量最多的病原分別為H9亞型AIV、NDRV、DHAV、ASTV，而檢出率最高的病原分別為DuCV、DTMUV、鴨病毒性肝炎病毒（DHAV）、鵝/番鴨細(xì)小病毒（GPV/MDPV）、鵝星狀病毒（GoAstV），陽性率分別為57.14%、40.00%、30.30%、26.32%、17.65%，這幾種病毒病依然是長期困擾水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病，見表2。

表2 2022年上半年水禽病毒病檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 家禽細(xì)菌病檢測結(jié)果

2022年上半年，本實(shí)驗(yàn)室對送檢禽病樣品1 085份進(jìn)行了大腸桿菌、副雞禽桿菌、沙門氏菌、滑液囊支原體、雞毒支原體、鴨疫里默氏桿菌等病原的檢測（表3），其中大腸桿菌、沙門氏菌、副雞禽桿菌、滑液囊支原體、雞毒支原體、鴨疫里默氏桿菌的檢測量較大，且大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、滑液囊支原體檢出率較高，需重點(diǎn)關(guān)注；雖然鏈球菌與葡萄球菌的送檢量不太大，但是檢出率均為100%需特別關(guān)注，詳見表3。細(xì)菌性疫病有其地方流行性，因此要結(jié)合本地的流行情況提前做好防控。

表3 常見細(xì)菌病檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.5 腫瘤病診斷結(jié)果

家禽的腫瘤病主要為網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病、禽白血病和馬立克氏病，對于這些腫瘤病來講，常規(guī)的病毒學(xué)和血清學(xué)方法在臨床診斷中缺少價值，主要采用病理學(xué)的方法進(jìn)行診斷。MDV感染可導(dǎo)致組織發(fā)生多種淋巴細(xì)胞浸潤，增生細(xì)胞為多形性的成熟或不成熟的淋巴細(xì)胞，H.E染色時淋巴細(xì)胞細(xì)胞核藍(lán)染。ALV感染主要引起大淋巴細(xì)胞、成紅細(xì)胞、成髓細(xì)胞、髓細(xì)胞不同形態(tài)聚積或浸潤，腫瘤細(xì)胞由聚集的大淋巴細(xì)胞組成，細(xì)胞多處于相同的發(fā)育階段，肝脾結(jié)節(jié)周圍有一層成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，髓細(xì)胞在H. E染色時表現(xiàn)為胞質(zhì)紅染。而REV的典型病變?yōu)閷?shí)質(zhì)細(xì)胞壞死和網(wǎng)狀細(xì)胞增生?；贛DV、ALV、REV感染后引起的組織學(xué)差別可進(jìn)行病理學(xué)鑒別診斷。

2022年上半年病理學(xué)腫瘤病診斷樣品301份，其中雞馬立克氏病48份，均未檢出；禽白血病檢測164份，陽性占比26.8%（44/164）；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥檢測89份，陽性占比25.8%（23/89）。禽腫瘤病的檢出率一直處于較高水平，對于腫瘤病的控制要從種源抓起，關(guān)于白血病及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的凈化時刻不能放松[15]。

3 討論

2022年上半年實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)顯示，禽病毒性疾病檢出率較多的病原為H9亞型AIV、IBV、IBDV、CIAV、MDV和水禽的DHAV、DuCV、GPV/MDPV、NDRV。疫苗免疫是防控疫病的有效措施之一，病毒性疫病的防控應(yīng)堅(jiān)持“預(yù)防為主、防治結(jié)合”的策略。根據(jù)養(yǎng)殖場具體情況制定合理的免疫程序，同時應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貎?yōu)勢流行分支毒株選用抗原性匹配好的疫苗，避免盲目使用疫苗。某些種類的活疫苗免疫后副反應(yīng)大，疫苗毒株安全性較差，免疫后帶毒時間長，存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險，因此應(yīng)慎重選擇活疫苗。同類型的活疫苗不易混合使用，避免毒株之間基因重組，形成新的流行毒株。

為了保證食品安全，避免抗生素濫用導(dǎo)致的日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥性問題，我國近年來出臺了一系列減抗、限抗、禁抗相關(guān)政策。這就要求針對細(xì)菌性疾病的診斷檢測必須準(zhǔn)確，結(jié)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果聯(lián)合用藥進(jìn)行防控。飼養(yǎng)過程中應(yīng)加強(qiáng)設(shè)施建設(shè)、優(yōu)化飼養(yǎng)環(huán)境，避免或降低應(yīng)激反應(yīng)，做好環(huán)境的消毒、強(qiáng)化衛(wèi)生條件，做好飲水和飼料檢測，避免病從口入。同時，做好病毒性疫病的防控，降低繼發(fā)細(xì)菌病的風(fēng)險。

由ALV、REV、MDV引起的腫瘤性疫病嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，這三種腫瘤性疾病世界各地均有流行。疫苗免疫是迄今為止預(yù)防MD的有效措施之一，免疫效果好，成本低。AL和RE目前尚無有效的疫苗和治療方法，須從種雞群凈化入手。另外，對活疫苗應(yīng)加強(qiáng)檢測，避免因?yàn)橐呙缥廴就庠床《緦?dǎo)致這三種腫瘤性疾病的流行。

臨床流行的諸多疫病，目前仍然無商品化疫苗可應(yīng)用于臨床，應(yīng)加強(qiáng)禽群飼養(yǎng)管理和清潔、消毒、墊料管理等生物安全管理，及時淘汰感染動物，防止疫病擴(kuò)散、流行。