買衛(wèi)紅，吳寧，張曉慧

周口市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 周口 466000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，最常見的病理類型為內(nèi)膜樣腺癌，約70%以上發(fā)生于絕經(jīng)老年女性，近年來EC發(fā)病趨于年輕化[1-2]。目前EC的診斷無(wú)特異性腫瘤標(biāo)志物，越來越多的學(xué)者致力于探索對(duì)EC診斷及嚴(yán)重程度預(yù)判等價(jià)值較高的血清學(xué)指標(biāo)，以期及早診斷疾病并及時(shí)予以相應(yīng)治療，進(jìn)而改善患者預(yù)后。一氧化氮是人體內(nèi)重要的細(xì)胞間信號(hào)傳遞因子，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，其由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）催化合成[3]。其中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）在正常組織中很少表達(dá)，在腫瘤組織或參與病理過程的炎性細(xì)胞中表達(dá)，已有研究表明其與淋巴瘤、肺癌、肝癌等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。可溶性腫瘤壞死因子受體（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）分為sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ兩種，分別來源于腫瘤壞死因子受體p55和p75的膜外段[7]。sTNFR與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）結(jié)合后阻斷了TNF與膜受體的結(jié)合，進(jìn)而抑制TNF功能，保護(hù)機(jī)體抵抗TNF的病理?yè)p傷，已有研究發(fā)現(xiàn)sTNFR水平變化在喉癌、宮頸癌等臨床診療中具有重要意義[8-9]。然而，針對(duì)iNOS及sTNFR與EC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究較為少見。本研究探討EC患者血清iNOS、sTNFR的水平及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2020年1月周口市人民醫(yī)院收治的55例首診為EC的患者作為EC組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2015年NCCN子宮內(nèi)膜癌臨床實(shí)踐指南解讀》[10]中EC診斷標(biāo)準(zhǔn)；②病理檢查結(jié)果為EC；③初診EC；④術(shù)前未行放化療、生物免疫治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他部位腫瘤未治愈；②有嚴(yán)重的心腦肝腎或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例EC患者，年齡24～65歲，平均（48.66±10.32）歲；子宮內(nèi)膜樣腺癌51例，其他4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期29例。選取55例同期子宮良性病變患者作為子宮良性病變組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①因子宮肌瘤等良性病變行子宮全切術(shù)；②病理檢查結(jié)果為良性；③術(shù)前未接受生物免疫療法。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他部位腫瘤未治愈；②有嚴(yán)重的心腦肝腎或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例子宮良性病變患者，年齡31～64歲，平均（49.31±11.46）歲；子宮肌瘤33例，子宮內(nèi)膜息肉12例，子宮肥大癥6例，子宮腺肌病4例。另選取55例同期同年齡段健康體檢的女性作為健康組，年齡 29～65歲，平均（49.14±10.58）歲。EC組、子宮良性病變組及健康組研究對(duì)象的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

取3組研究對(duì)象晨起空腹靜脈血3 ml，離心（3000 r/min，10 min，離心半徑12 cm）分離出血清后置于-20℃冰箱中保存待檢。

iNOS檢測(cè)[11]：采取雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法，采用抗人iNOS抗體包被微孔板，制成固相抗體，包被單抗的微孔中依次加入iNOS，再與辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的iNOS抗體相結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶底物四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），出現(xiàn)黃色時(shí)加入硫酸終止，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（optical density，OD）值，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中iNOS濃度。

sTNFR檢測(cè)[12]：包括sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ，采取雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，采用抗人sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ和單抗結(jié)合，加入生物素化的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ抗體，形成免疫復(fù)合物，HRP標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白與生物素相結(jié)合，加入酶底物鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD），出現(xiàn)黃色時(shí)加入硫酸終止，在492 nm處測(cè)得OD值，sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ值與OD值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ濃度。

1.3 觀察指標(biāo)

比較EC組、子宮良性病變組及健康組研究對(duì)象血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平，比較Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期EC患者血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平。對(duì)手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，分析EC患者血清iNOS及sTNFR異常表達(dá)與臨床特征的關(guān)系及影響因素。以iNOS≥1.23 U/ml、sTNF-R Ⅰ≥1.18 ng/ml、sTNF-R Ⅱ≥3.93 ng/ml為高表達(dá)[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清iNOS及sTNFR水平的比較

EC組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宮良性病變組及健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；子宮良性病變組與健康組血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 EC組、子宮良性病變組及健康組研究對(duì)象血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

表1 EC組、子宮良性病變組及健康組研究對(duì)象血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

注：a與健康組比較，P＜0.05；b與子宮良性病變組比較，P＜0.05

組別EC組（n=55）子宮良性病變組（n=55）健康組（n=55）F值P值1.33±0.38a b 0.86±0.25 0.81±0.21 54.102 0.000 1.54±0.41a b 0.84±0.26 0.78±0.20 106.848 0.000 4.36±0.71a b 2.79±0.64 2.71±0.61 111.082 0.000 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較

Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

病理分期Ⅰ～Ⅱ（n=26）Ⅲ～Ⅳ（n=29）t值P值1.12±0.29 1.52±0.43 3.996 0.000 1.40±0.36 1.67±0.52 2.213 0.031 4.12±0.66 4.58±0.74 2.421 0.019 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.3 不同臨床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表達(dá)情況的比較

不同病理分期、分化程度及子宮肌層浸潤(rùn)深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表達(dá)情況的比較（n=55）

2.4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表達(dá)影響因素的多因素分析

病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宮肌層浸潤(rùn)深度＞1/2均為EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表4）

表4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表達(dá)影響因素的多因素分析

3 討論

EC是危害女性生命安全的常見惡性腫瘤之一，主要發(fā)生于子宮內(nèi)膜腺體，以腺癌最常見[14]。EC好發(fā)于絕經(jīng)老年女性，惡性程度較高，由于早期癥狀不足以引起重視，大多數(shù)患者就診時(shí)已至中晚期，預(yù)后相對(duì)較差[15]。因此，將EC早期篩查與診斷、有助于治療方案制訂的分子標(biāo)志物尋找出來，并探索其中的關(guān)系具有重要的臨床價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，EC組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宮良性病變組及健康組，子宮良性病變組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNFR Ⅱ水平與健康組無(wú)明顯差異，這一結(jié)果與姜臘元和謝暉[16]、陸林和陸志剛[17]研究結(jié)果具有一定相似性，提示iNOS與sTNFR在EC的發(fā)生中起到一定促進(jìn)作用。國(guó)外也早有研究報(bào)道與本研究結(jié)果相似，Li等[18]證實(shí)iNOS與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Gadducci等[19]發(fā)現(xiàn)sTNFR在EC患者血清中水平顯著升高。iNOS主要存在于白細(xì)胞等炎性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，正常情況下不表達(dá)，在病理?xiàng)l件下大量表達(dá)，而iNOS催化產(chǎn)生的高濃度NO則參與腫瘤的形成[20]。機(jī)體內(nèi)NO的半衰期較短，因此可通過檢測(cè)iNOS水平間接反映NO的生成情況。另一方面，正常人體內(nèi)的TNF和sTNFR處于平衡狀態(tài)，低濃度sTNFR具有運(yùn)載TNF的作用，協(xié)助抑制腫瘤細(xì)胞增殖和破壞細(xì)胞，高濃度sTNFR則與TNF結(jié)合后阻止TNF與TNFR的結(jié)合，進(jìn)而抑制TNF的多種生理功能。當(dāng)EC發(fā)生后，腫瘤組織刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF以阻止腫瘤的發(fā)展，與此同時(shí)腫瘤本身也在刺激作用下產(chǎn)生膜TNFR，其中部分脫落至細(xì)胞間質(zhì)，形成了可溶形式，即sTNFR，與TNFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TNF，降低TNF的抗腫瘤作用，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤免疫逃逸的作用[21]。本研究中Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，這一結(jié)果提示iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平與病理分期有一定聯(lián)系，各指標(biāo)水平越高，腫瘤惡性程度越高。

本研究表明，不同病理分期、分化程度及子宮肌層浸潤(rùn)深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宮肌層浸潤(rùn)深度＞1/2均為EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。這說明iNOS、sTNFR的高表達(dá)與EC嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示腫瘤惡性程度較高，也意味著預(yù)后可能相對(duì)不佳。這對(duì)EC的治療也有一定的提示意義，iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達(dá)表明腫瘤惡性程度高，術(shù)后需進(jìn)一步行放化療，反之腫瘤惡性程度低，考慮術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療即可[22]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是評(píng)判EC嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，本研究中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ的高表達(dá)與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)系，這一結(jié)果可能受研究納入病例數(shù)較少等因素影響而存在偏倚。

綜上所述，EC患者血清中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均升高，且晚期患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于早期患者，各指標(biāo)高表達(dá)與病理分期、分化程度、子宮肌層浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，這提示iNOS與sTNFR等分子的檢測(cè)對(duì)早期診斷EC、制訂合理的治療方案、判斷疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要的臨床意義，未來還需更多的臨床研究和數(shù)據(jù)加以探索證實(shí)。