劉翼，吳強，張曉明，曾薇

1深圳大學總醫(yī)院胸心外科，廣東 深圳 518055

2新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外二科，烏魯木齊 830011

3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腫瘤科，廣州 510515

肺癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤首位[1]。早期非小細胞肺癌患者由于診斷方法的局限且缺乏特異性癥狀，診斷較為困難，當患者出現(xiàn)臨床癥狀就診時多數(shù)已處于腫瘤晚期，不適合進行手術切除，5年生存率不足20%[2]。因此，確定與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關的分子靶點具有重要意義。GTP酶免疫相關蛋白（GTPase of immunity-associated protein，GIMAP）廣泛存在于各種動植物細胞以及某些細菌中，與免疫系統(tǒng)緊密聯(lián)系。目前發(fā)現(xiàn)的7種人源GIMAP家族基因均分布于染色體7q36.1，其編碼相對分子量為33 000～75 000的蛋白質(zhì)[3]。GIMAP蛋白家族在淋巴細胞相關疾病中發(fā)揮重要作用，其機制是GIMAP蛋白家族對淋巴細胞成熟、凋亡等生物學過程的調(diào)控[4]。GIMAP8是GIMAP家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)GIMAP8mRNA在子宮內(nèi)膜癌[5]、乳腺癌[6]等多種惡性腫瘤中異常表達，并且與患者預后密切相關，提示GIMAP8可作為潛在的預后預測因子。然而，GIMAP8在肺腺癌中的表達及意義未見相關報道。本研究通過對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中2021年5月30日之前納入的肺腺癌表達譜數(shù)據(jù)及患者臨床資料進行分析，探討GIMAP8在肺腺癌中的表達情況及其與肺腺癌患者臨床特征、預后的關系，并分析GIMAP8在肺腺癌中可能參與的信號通路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集

從 TCGA 官方網(wǎng)站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載肺腺癌的表達譜數(shù)據(jù)及患者臨床資料。其中，基因表達譜數(shù)據(jù)包括肺腺癌組織樣本497例，正常肺組織樣本59例，具有相關臨床特征資料的樣本385例。整理RNASeq樣本，刪除臨床資料中失訪及信息不完整的病例。提取GIMAP8單基因樣本及相對應的臨床資料樣本，分析GIMAP8在肺腺癌和正常肺組織中的表達差異。

1.2 研究方法

1.2.1 GIMAP8表達與肺腺癌患者臨床特征及預后的關系及驗證 從385例臨床樣本中選取性別、年齡、T分期、N分期、M分期、美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期作為肺腺癌臨床特征指標，去除臨床特征缺失或者不完全的病例69例，以GIMAP8在肺腺癌組織中表達水平的中位數(shù)（3.217）為界限，將肺腺癌患者分為GIMAP8高表達組（142例）和GIMAP8低表達組（174例），比較兩組患者臨床特征的差異。利用單因素及多因素Cox模型分析各臨床特征與肺腺癌患者預后的關系。分析GIMAP8高表達組、低表達組患者總生存期（overall survival，OS）的差異；利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫對肺腺癌數(shù)據(jù)集進行生存分析，進一步驗證GIMAP8的預后價值。

1.2.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 采用GSEA 4.1.0軟件分析影響GIMAP8表達的通路。選用GSEA中C2.cp.kegg.V7.4.symbols.gmt規(guī)范化基因集，運用缺省加權富集統(tǒng)計方法，每次分析對基因組進行1000次排列。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素分析采用單因素及多因素Cox比例風險回歸模型；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織、正常肺組織中GIMAP8表達水平的比較

GIMAP8在497例肺腺癌組織中的表達水平為（4.145±3.174），明顯低于59例正常肺組織的（20.916±9.429），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在52對配對樣本中，肺腺癌組織中GIMAP8表達水平為（4.792±3.563），明顯低于正常肺組織的（21.048±9.546），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 肺腺癌組織中GIMAP8表達情況與患者臨床特征的關系

不同年齡、性別、臨床分期、T分期、M分期、N分期肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達情況的比較

2.3 肺腺癌患者預后影響因素的單因素及多因素分析

對預后的影響因素進行Cox回歸分析，單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期、T分期、N分期均可以作為肺腺癌潛在的預后因素（P＜0.01）；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）為肺腺癌患者預后的獨立影響因素。（表2）

表2 肺腺癌患者預后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 GIMAP8表達與肺腺癌患者生存情況的關系

TCGA數(shù)據(jù)庫中GIMAP8低表達肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達患者（P＜0.01）（圖1）。Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，GIMAP8低表達肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達患者（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）（圖2）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中GIMAP8高表達（n=142）與低表達（n=174）肺腺癌患者的生存曲線

圖2 Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫中GIMAP8高表達（n=932）與低表達（n=948）肺腺癌患者的生存曲線

2.5 GIMAP8基因相關信號通路

GIMAP8基因低表達樣本主要富集在氧化磷酸化、嘧啶代謝、RNA聚合酶、基底切除修復、蛋白酶體以及乙醛酸和二羧酸代謝等信號通路中。（表3）

表3 GIMAP8的功能富集分析

3 討論

肺腺癌是非小細胞肺癌中發(fā)生率最高的一類，占40%以上，并有升高的趨勢[6]。由于缺乏早期臨床癥狀，部分肺腺癌患者確診時已處于晚期，治療效果及預后均較差。發(fā)現(xiàn)新的分子標志物能夠?qū)Ψ伟┑脑\斷及治療提供理論依據(jù)，意義重大。

GIMAP基因位于染色體7q35-7q36.1區(qū)域，編碼一個主要在免疫系統(tǒng)中表達的蛋白質(zhì)家族。GIMAP基因能夠促進免疫功能，如胸腺細胞發(fā)育、外周血淋巴細胞凋亡和T細胞分化。當這些基因改變時可導致與免疫相關的疾病發(fā)生，如T淋巴細胞減少、急性髓系白血病和自身免疫性疾病[7-9]。研究表明，GIMAP在不同腫瘤組織和細胞系中低表達，因此，GIMAP除了參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)外，還可能作為抑癌基因發(fā)揮作用[10-12]。有文獻報道，GIMAP4可促進細胞凋亡[13]，而GIMAP6在自噬過程中發(fā)揮重要作用[14]。一項關于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的研究中，Huang等[15]發(fā)現(xiàn)，與配對的非腫瘤組織樣本和健康受試者血液樣本相比，HCC腫瘤樣本和HCC患者血液樣本中GIMAP5、GIMAP6mRNA表達顯著下調(diào)。Mégarbané等[16]對18例健康女性、16例導管原位癌女性患者、13例三陰性乳腺癌女性患者和15例人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌女性患者的GIMAPmRNA表達進行檢測，結(jié)果顯示，乳腺癌患者GIMAP4、GIMAP6、GIMAP7、GIMAP8mRNA 水平均較健康女性顯著降低，并提示這些基因可能通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡或控制細胞周期發(fā)揮乳腺癌抑制基因的作用。Krücken等[17]研究表明，GIMAP8定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體，GIMAP8mRNA在胸腺組織中高表達，在心臟、皮膚和肺組織中低表達[17-19]。GIMAP8具有獨特結(jié)構(gòu)，因其具有3個GTP結(jié)合域，表明它可能發(fā)揮不同于其他GIMAP家族成員的作用。GIMAP8不同GTP結(jié)合域之間保守序列的差異可能對GIMAP8的整體功能也很重要。本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析正常肺組織與肺腺癌組織中GIMAP8表達差異，并分析其與臨床特征和預后的關系，研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中GIMAP8表達水平明顯低于正常肺組織（P＜0.01）；不同年齡、性別、臨床分期、T分期、M分期、N分期肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；GIMAP8低表達肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達患者（P＜0.01）；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）為肺腺癌患者預后的獨立影響因素。本研究利用GSEA方法預測GIMAP8可能的調(diào)控信號通路，發(fā)現(xiàn)GIMAP8基因低表達樣本主要富集在氧化磷酸化、嘧啶代謝、RNA聚合酶、基底切除修復、蛋白酶體以及乙醛酸和二羧酸代謝等信號通路中。

綜上所述，肺腺癌組織中GIMAP8低表達，且與預后有關，可能是肺腺癌診斷和治療的潛在生物標志物。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌的測序數(shù)據(jù)，納入大量樣本，臨床資料相對完整，為研究GIMAP8在肺腺癌中的作用機制提供依據(jù)。在后續(xù)的研究中，課題組將采用聚合酶鏈反應、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和免疫組化法驗證GIMAP8的表達情況，并進一步檢測肺腺癌患者GIMAP8在免疫治療、靶向治療等中是否會發(fā)生變化，研究其作用機制，為肺腺癌的靶向治療提供新思路。