趙林艷 官會(huì)林 王克書 盧燕磊 向萍 魏富剛 楊紹周 徐武美

（1.云南師范大學(xué) 高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測(cè)研究站，昆明 650500；2.西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境修復(fù)與健康研究院，昆明 650224；3.文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司，文山 663000）

土壤含水量是影響微生物活動(dòng)及其生態(tài)功能的關(guān)鍵土壤因子［1-2］。不同微生物菌群對(duì)土壤含水量變化具有不同的響應(yīng)特征，因此，土壤含水量直接或間接地影響著微生物群落組成［3］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在土壤環(huán)境中的移動(dòng)和獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高度依賴于土壤中水膜的運(yùn)動(dòng)，因此在干旱脅迫下，細(xì)菌群落所受的影響往往要高于真菌群落［4-5］。然而，在濕潤(rùn)土壤中，真菌群落對(duì)含水量變化更加敏感［6］。土壤含水量對(duì)致病菌群具有直接影響，因此與植物土傳病害密切相連［7-9］。研究表明，當(dāng)土壤含水量高于24.0%時(shí)，生姜姜瘟病發(fā)病率隨土壤含水量的升高而升高［7］；此外，西洋參根腐病與番茄筋腐病的發(fā)生也與土壤含水量密切相關(guān)［8-9］。

三七（Panax notoginseng）是我國(guó)名貴中藥材，具有散瘀止血、消腫止痛的功效，然而連作障礙極大地限制了其可持續(xù)生產(chǎn)［10］。研究表明，三七連作后會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落變化，鐮刀菌（Fusarium spp.）等病原真菌相對(duì)豐度增加，而具有拮抗病原菌作用的木霉與放線菌等數(shù)量減少［1］。連作三七的發(fā)病高峰期為6-8月，可能是因?yàn)闀r(shí)值雨季，降水豐沛，土壤含水量高，引發(fā)三七根腐病害［11-12］。當(dāng)前，針對(duì)三七連作障礙的消減研究主要側(cè)重于部分土壤理化因子與肥力改良方面［13］，而通過(guò)田間水分管理消減三七連作障礙的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期研究表明，當(dāng)雨季土壤含水量為25%-35%時(shí)，三七存活率與土壤含水量呈顯著負(fù)相關(guān)［10］；然而，其內(nèi)在機(jī)理，特別是土壤微生物群落與關(guān)鍵致病菌群對(duì)土壤含水量的響應(yīng)變化仍不清楚。因此，本研究以8年三七連作土壤為對(duì)象，通過(guò)室內(nèi)土培實(shí)驗(yàn)與高通量測(cè)序分析，探索土壤含水量影響連作三七根腐病害的內(nèi)在機(jī)理，揭示三七發(fā)病高峰出現(xiàn)在雨季的主要原因，為從田間水分管理的角度消減三七連作障礙提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤采自云南文山苗鄉(xiāng)三七科技示范園（23° 31' 44.48″ N，104° 19' 13.65″ E），三七連作 8 年，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.01，電導(dǎo)率201.33 μS/cm，有效氮含量26.63 mg/kg，有效磷含量18.21 mg/kg，有效鉀含量157.52 mg/kg。準(zhǔn)確稱取3 000 g（干重）三七連作土壤于直徑14 cm、高16 cm的實(shí)驗(yàn)盆中，采用稱重法設(shè)置4個(gè)土壤含水量梯度，分別為10%（W1）、20%（W3）、30%（W3）與 40%（W4），每個(gè)處理重復(fù)3次。在溫室內(nèi)自然培養(yǎng)70 d，隨后采集一部分土樣置于-80℃冰箱保存，用于微生物群落高通量測(cè)序分析，另一部分土樣自然風(fēng)干后，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì) 風(fēng)干土壤過(guò)2 mm篩后，參照《土壤農(nóng)化分析》一書進(jìn)行理化因子測(cè)定［14］。土壤pH使用pH計(jì)（雷磁PHS-25）進(jìn)行測(cè)定；電導(dǎo)率（EC）使用EC計(jì)（COMBI 5000）進(jìn)行測(cè)定；銨態(tài)氮（NH4+-N）與硝態(tài)氮（NO3--N）含量使用連續(xù)流動(dòng)分析儀（Seal Analytical AA3）進(jìn)行測(cè)定；有效磷（AP）含量使用鉬銻抗比色法進(jìn)行測(cè)定；有效鉀（AK）含量使用連續(xù)流動(dòng)火焰分光光度計(jì)（AA3，Model 410）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 土壤總DNA提取與高通量測(cè)序 稱取1 g土壤樣品，利用DNA提取試劑盒（NucleoSpin Kit，Macherey-Nagel GmbH，Germany）提取微生物總DNA。細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增；真菌ITS片段使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增片段采用AMPure XP試劑盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)（Promega，USA）進(jìn)行純化和定量。采用Illumina HiSeq 2500 PE250進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用FLASH v1.2.7［15］對(duì)雙端測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接，并用Trimmomatic［16］軟件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，使用UCHIME v4.2［17］鑒定并去除嵌合體，使用UPARSE［18］軟件按97%的序列相似度劃分 OTUs（operational taxonomic units）。使用RDP軟件以細(xì)菌16S rRNA Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.arb-silva.de）和真菌ITS UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（https://unite.ut.ee/）為參考，對(duì)OTU進(jìn)行分類注釋。使用MOTHUR［19］軟件計(jì)算各土壤樣品微生物多樣性，包括OTU豐富度、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)與系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（phylogenetic diversity，PD）。

利用單因素方差分析比較不同土樣理化性質(zhì)的差異顯著性；利用Bray-Curtis距離指數(shù)進(jìn)行不同微生物群落非度量多維尺度（NMDS）分析與相似性分析（ANOSIM）。以上分析均利用R軟件包“vegan”與SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）進(jìn)行［20-21］。

2 結(jié)果

2.1 土壤含水量對(duì)微生物群落組成的影響

在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為三七連作土壤中優(yōu)勢(shì)真菌類群。W1處理下子囊菌門相對(duì)豐度最高且顯著高于其他處理（圖1-A）；擔(dān)子菌門相對(duì)豐度隨土壤含水量的增加而升高。變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，其相對(duì)豐度在不同處理下均無(wú)顯著差異（圖1-B）。在屬分類水平上，鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）和被孢霉屬（Mortierella）為優(yōu)勢(shì)真菌類群，在W1中占比分別為38.34%、11.86%與3.33%，在W2中占比分別為39.53%、13.75%與7.13%，在W3中占比分別為3.89%、35.21%與5.53%，在W4中占比分別為7.01%、15.69%與4.51%。單因素方差分析與Duncan多重比較表明，W3和W4處理下鐮刀菌屬相對(duì)豐度顯著低于W1和W2（P＜0.01），且W3處理下其相對(duì)豐度最低。然而，W3處理下，木霉屬的相對(duì)豐度最高，且顯著高于其他處理。W2處理下，被孢霉屬的相對(duì)豐度最高，且顯著高于W1（圖2）。異多棒菌屬（Xenopolyscytalum）與紫孢霉屬（Purpureocillium）的相對(duì)豐度隨土壤含水量的增加而顯著降低（P＜0.05）。W3處理下，青霉屬（Penicillium）的相對(duì)豐度最低，但與W2相比無(wú)顯著差異（圖2）。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和Escherichia_Shigella為屬分類水平的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，在W1中占比分別為8.26%與5.37%，在W2中占比為分別10.03%與8.62%，在W3中占比分別為4.18%與0.69%，在W4中占比分別為4.66%與0.13%。W2處理下，鞘氨醇單胞菌屬和Escherichia_Shigella的相對(duì)豐度顯著高于W3與W4（P＜0.05）。

圖1 不同含水量處理下土壤微生物門分類水平的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundances of microorganisms at the phylum level under different soil moisture treatments

圖2 不同含水量處理下土壤代表性微生物屬的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundances of soil representative microbial genera under different soil moisture treatments

2.2 土壤含水量對(duì)微生物群落alpha多樣性的影響

對(duì)12個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測(cè)序共獲得2 096 786條真菌ITS序列和949 300條細(xì)菌16S rRNA序列，根據(jù)97.0%的相似度劃分OTU，共得到真菌OTU 1 058個(gè)，隸屬于8門、30綱、71目、148科、276屬、303種；共得到細(xì)菌OTU 1 972個(gè)，隸屬于33門、91綱、203目、343科、633屬、696種。不同處理下均有分布的真菌OTU數(shù)為178個(gè)，W1特有OTU數(shù)為110個(gè)，W2為113個(gè)，W3為94個(gè)，W4為160個(gè)。不同處理下均有分布的細(xì)菌OTU數(shù)為1 551個(gè)，W1和W2無(wú)特有OTU，W3特有OTU數(shù)為51個(gè)，W4為18個(gè)（圖3）。由于不同土樣測(cè)序量存在差異，故用稀疏標(biāo)準(zhǔn)化（rarefaction）的方法比較不同微生物群落OTU豐富度（OTU richness）（圖4）。W4處理下真菌OTU豐富度較高，但與其他處理相比無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖5），Chao1、Shannon與PD多樣性指數(shù)隨土壤含水量的增加呈升高趨勢(shì)；細(xì)菌多樣性指數(shù)在不同處理下均無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖5）。

圖3 不同土壤含水量處理下共有和特有的OTU數(shù)量Fig.3 Number of shared and unique OTUs under different soil moisture treatments

圖4 不同含水量處理下土壤真菌與細(xì)菌OTU豐富度的稀疏曲線Fig.4 Rarefaction curves for fungal and bacterial OTU richness under different soil moisture treatments

圖5 不同土壤含水量處理對(duì)微生物群落alpha多樣性的影響Fig.5 Alpha diversities of soil microbial community under different soil moisture treatments

2.3 土壤含水量對(duì)微生物群落beta多樣性的影響

基于Bray-Curtis距離指數(shù)的NMDS分析結(jié)果表明，W1和W2具有相似的真菌群落特征，且與W3、W4呈明顯的分化格局（圖6-A）。與真菌群落相比，細(xì)菌群落分化相對(duì)較小（圖6-B）。ANOSIM分析表明，不同土壤含水量處理下，真菌、細(xì)菌群落組間距離均高于組內(nèi)距離（P＜0.05；圖6-C，D）；與細(xì)菌群落相比，真菌群落組間分化更大，與NMDS分析結(jié)果一致。

圖6 基于Bray-Curtis距離指數(shù)的不同處理間微生物群落NMDS分析和ANOSIM分析結(jié)果Fig.6 NMDS and ANOSIM results of microbial communities under different treatments based on Bray-Curtis distance

2.4 土壤含水量對(duì)相關(guān)土壤因子的影響

不同土壤含水量處理對(duì)pH、EC值與AP、AK含量均未產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)NH4+-N和NO3--N含量具有顯著影響（P＜0.01，表1）。Duncan多重比較分析表明，當(dāng)土壤含水量達(dá)到40%時(shí)，土壤中NH4+-N含量顯著增加，而NO3--N含量顯著降低（圖7）。

圖7 不同土壤含水量處理對(duì)NH4+-N與NO3--N含量的影響Fig.7 Effects of different soil moisture treatments on the contents of soil NH4+-N and NO3--N

表1 不同土壤含水量處理影響三七連作土壤理化性質(zhì)的單因素方差分析結(jié)果Table 1 Results of one-way ANOVA for the soil physicochemical properties under continuous cropping of P.notoginseng with different moisture treatments

2.5 土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢(shì)微生物菌群的關(guān)聯(lián)性

利用冗余分析（RDA）探索土壤含水量（MC）、pH、EC值、NH4+-N、NO3--N、AP、AK含量與代表性微生物屬分布的關(guān)聯(lián)性。針對(duì)真菌類群的RDA分析表明，前兩個(gè)約束軸（RDA1與RDA2）的解釋率分別為73.19%與9.29%，土壤含水量與木霉屬、被孢霉屬的分布呈正相關(guān)，與鐮刀菌屬、紫孢霉屬、異多棒菌屬的分布呈負(fù)相關(guān)（圖8-A）。針對(duì)細(xì)菌類群的RDA分析表明，RDA1與RDA2的解釋率分別為48.89%與12.01%。土壤含水量與Ramlibacter等的分布呈正相關(guān)，與鞘氨醇單胞菌屬和Escherichia_Shigella的分布呈負(fù)相關(guān)（圖8-B）。

圖8 不同土壤含水量處理下真菌（A）和細(xì)菌（B）群落的RDA分析結(jié)果Fig.8 RDA analysis of soil fungal（A）and bacterial community（B）under different moisture treatments

3 討論

土壤含水量變化不僅影響?zhàn)B分元素的物理擴(kuò)散與化學(xué)形態(tài)轉(zhuǎn)化［22］，同樣也影響著土壤微生物群落組成與生態(tài)功能［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量的增加，三七連作土壤pH、EC值與AP、AK含量均無(wú)顯著變化，但顯著增加了NH4+-N含量，降低了NO3--N含量，主要是因?yàn)橥寥篮枯^高時(shí)影響了土壤透氣性，進(jìn)而抑制了硝化作用，促進(jìn)了銨態(tài)氮的積累，并導(dǎo)致硝態(tài)氮含量降低［23］。Chen等［24］也研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量增加，銨態(tài)氮含量呈升高趨勢(shì)。研究表明，土壤中NH4+的積累會(huì)對(duì)三七生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫，并抑制植株的生長(zhǎng)與抗病害能力［25］。

本研究發(fā)現(xiàn)，真菌多樣性隨土壤含水量的增加而增加，而細(xì)菌多樣性的變化不顯著，且不同處理下真菌群落分化更為明顯，表明真菌群落對(duì)三七連作土壤含水量變化的響應(yīng)更加敏感；然而，其內(nèi)在機(jī)理，特別是與三七連作障礙的關(guān)聯(lián)性，還有待進(jìn)一步探索。鞘氨醇單胞菌屬和Escherichia_Shigella的相對(duì)豐度在土壤含水量為20%時(shí)最高，RDA分析結(jié)果顯示，其與土壤含水量和NH4+-N含量呈負(fù)相關(guān)，而與NO3--N含量呈正相關(guān)。已有研究表明，鞘氨醇單胞菌屬和Escherichia_Shigella與氮素循環(huán)密切相關(guān)，因此當(dāng)土壤含水量較高時(shí)，其相對(duì)豐度降低，可能影響了三七連作土壤氮素轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致土壤銨態(tài)氮的積累與硝態(tài)氮含量降低［26-27］。

異多棒菌屬、紫霉屬和青霉屬等真菌的相對(duì)豐度隨土壤含水量的增加而顯著降低。異多棒菌屬在纖維素降解方面發(fā)揮著重要作用［28］；紫霉屬和青霉屬具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能［29-30］，同樣也是具有生防作用的真菌［31-32］。此外，土壤含水量為20%時(shí)，鐮刀菌屬相對(duì)豐度最高，當(dāng)含水量達(dá)30%時(shí)，其相對(duì)豐度大幅降低。已有研究表明，土壤濕度越大，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）豐度越低［33］；鐮刀菌屬真菌在土壤含水量為15%左右時(shí)生長(zhǎng)狀況最佳［34］，結(jié)合本研究結(jié)果，說(shuō)明較低的土壤含水量（＜20%）有利于鐮刀菌屬的生長(zhǎng)繁殖。研究表明，鐮刀菌屬是三七根腐病株根際土壤中的主要菌群，其中尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌（F.solani）和柔毛鐮刀菌（F.flocciferum）等病原真菌均可導(dǎo)致三七根腐病害［35-37］。在本研究中，當(dāng)土壤含水量為30%時(shí)，鐮刀菌屬的相對(duì)豐度大幅降低，而木霉屬的相對(duì)豐度大幅升高。木霉屬在土壤中的生態(tài)作用主要是分解植物殘留物，也可通過(guò)產(chǎn)生抗真菌代謝物、空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌細(xì)胞壁降解酶，并利用寄主菌絲為營(yíng)養(yǎng)源等抑制病原菌的生長(zhǎng)［38-39］。木霉適宜生長(zhǎng)在潮濕的環(huán)境中［40］，已有研究表明，當(dāng)土壤含水量為32%-42%時(shí)，顯著促進(jìn)了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的生長(zhǎng)，并降低了豆科植物病害程度［41］。王勇等［42］研究表明，三七植株以雨季根腐病害最為嚴(yán)重，文增葉［43］和王朝梁等［44］研究指出，鐮刀菌是造成三七根腐病最主要的病原菌，抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)是消減三七連作障礙的關(guān)鍵措施。因此，通過(guò)合理調(diào)節(jié)土壤含水量，抑制致病菌并促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng)，改善微生物群落，是防控三七根腐病害的有效措施。本研究表明，土壤含水量在30%左右時(shí)，鐮刀菌屬相對(duì)豐度最低，木霉相對(duì)豐度最高，有利于防控三七根腐病害；然而，這與我們的田間調(diào)查結(jié)果存在一定的差異［10］，可能是復(fù)雜的田間環(huán)境所致，因此還需進(jìn)一步開展大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

不同土壤含水量處理顯著影響了土壤真菌群落，對(duì)細(xì)菌群落的影響相對(duì)較小。當(dāng)土壤含水量低于20%時(shí)，有利于致病菌鐮刀菌等的生長(zhǎng)，當(dāng)土壤含水量為30%時(shí)，促進(jìn)有益菌木霉等的生長(zhǎng)，抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)。此外，本研究還揭示，當(dāng)土壤含水量為40%時(shí)，顯著促進(jìn)了土壤NH4+-N的積累。因此，土壤含水量過(guò)高或過(guò)低都不利于防控三七根腐病害，將含水量控制在30%左右為佳。