洪天澍 海英 恩和巴雅爾 高峰

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022；2.內(nèi)蒙古興安盟科爾沁右翼前旗第一中學(xué)，興安盟 137400）

三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP-binding cassette）蛋白又稱(chēng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一個(gè)廣泛存在、種類(lèi)繁多的超家族，它以ATP水解酶為能源，促進(jìn)多種底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，大多數(shù)ABC基因編碼的膜結(jié)合蛋白直接參與多種分子的跨膜運(yùn)輸［1］，植物ABC蛋白家族由3種結(jié)構(gòu)類(lèi)型組成，其包括完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、可溶性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domains，TMD）和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domains，NBD）組成，半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由一個(gè)TMD和一個(gè)NBD組成，通過(guò)形成同二聚體、異二聚體或多聚體來(lái)行使功能。第三類(lèi)型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白沒(méi)有TMD，但有兩個(gè)NBD，這類(lèi)蛋白稱(chēng)為可溶蛋白類(lèi)型［2］，它們都有一個(gè)胞質(zhì)的核苷酸結(jié)合域（NBD）。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，植物ABC蛋白不僅參與了激素、脂質(zhì)、金屬、次生代謝物和外源物質(zhì)的運(yùn)輸，而且還參與了植物與病原菌的相互作用和離子通道的調(diào)節(jié)［3］。在高等植物中，ABC蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上被組織成8個(gè)簇，即ABCAABCI亞家族（植物中不存在ABCH）［4］。ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最大的亞家族，在擬南芥和水稻中均有40多個(gè)成員［5］，其結(jié)構(gòu)為NBD-TMD，這種結(jié)構(gòu)只有經(jīng)過(guò)二聚才能成為功能型轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABCG亞家族可分為半分子式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和全分子式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩類(lèi)，并且功能多樣化。與其他類(lèi)型生物相比，ABCG亞家族在植物中的比例要大得多。其原因在于植物的固著生活方式，例如需要輸出有毒化合物和植物產(chǎn)生的種類(lèi)繁多的次生代謝物，這些次生代謝物通常需要跨膜運(yùn)輸?shù)剿鼈兊淖饔貌课唬?］。研究得知，植物ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族成員具有參與植物激素傳遞（包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和獨(dú)角金內(nèi)酯等）功能［7］；ABCG全分子式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物體內(nèi)抗重金屬、抗病原菌、生長(zhǎng)素應(yīng)答、轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)分子等功能［8-10］，而ABCG半分子式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物體內(nèi)卡那霉素抗性、脂類(lèi)平衡、脫落酸轉(zhuǎn)運(yùn)等功能［11-13］。表皮細(xì)胞的形成與角質(zhì)層的合成對(duì)植物果實(shí)的生長(zhǎng)具有重要作用［14］，有研究報(bào)道，AtABCG11參與擬南芥葉片和莖部角質(zhì)形成，AtABCG13參與擬南芥花組織的角質(zhì)形成［15］，水稻中OsABCG26和OsABCG15通過(guò)絨氈層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)脂類(lèi)。在人體中HsABCG5與HsABCG8共同作用可以促進(jìn)多種底物跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。

甜瓜（Cucumis melo L.）是廣泛栽培的重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物。其果實(shí)香甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含糖、淀粉、少量蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等。隨著對(duì)甜瓜研究的深入，甜瓜已經(jīng)成為闡明肉質(zhì)果實(shí)發(fā)育成熟分子機(jī)理的植物。近年來(lái)，甜瓜轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)的廣泛運(yùn)用，使得甜瓜具有抗病、抗逆、耐鹽堿等優(yōu)良特性。目前，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因的功能在甜瓜中研究較少，甜瓜中ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究還尚未可知。因此，對(duì)于ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在甜瓜中的功能及作用還需要進(jìn)一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜品種‘河套密瓜’，由本實(shí)驗(yàn)室 保 存。1/2 MS培 養(yǎng) 基、MnCl2、CuSO4、FeSO4、細(xì)胞分裂素（CTK）、油菜素內(nèi)酯（BR）、過(guò)氧化氫（H2O2）等試劑購(gòu)自呼和浩特洪陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、熒光定量PCR試劑 SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜CmABCG8基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 通過(guò)NCBI網(wǎng)站和MELONOMICS（https://www.melonomics.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜4個(gè)物種的ABCG家族基因序列，通過(guò)MEGA7軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor joining的方法做進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)中甜瓜ABCG家族表達(dá)量分析 通過(guò)CuGenDB（http://cucurbitgenomics.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)得到甜瓜ABCG亞家族成員在根、果實(shí)、葉、雄蕊、雌蕊的表達(dá)量，使用TBtools軟件做成熱圖，對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.3 甜瓜CmABCG8基因的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 通過(guò)STRING（https://cn.string-db.org/）網(wǎng)站分析CmABCG8氨基酸序列，得到與其互作的蛋白數(shù)據(jù)導(dǎo)出后用Cytoscape軟件做圖。

1.2.4 甜瓜種植及處理 甜瓜種植于內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市磴口縣，在甜瓜盛花期使用人工自交授粉，標(biāo)記授粉起始日期。果實(shí)的采摘從授粉后開(kāi)始，取所摘果實(shí)的中果皮組織，速凍于液氮中保存，每隔5 d采一次，直到授粉后的50 d為止；當(dāng)生長(zhǎng)期到40 d時(shí)取根、莖、葉和花4種組織，速凍于液氮中保存；選取籽粒飽滿、大小均一的甜瓜種子種植于營(yíng)養(yǎng)土中，待其長(zhǎng)出第2片真葉后，進(jìn)行不同的處理。其中，取甜瓜根部，用于金屬離子處理。離 子 濃 度 分 別 為 Fe2+、Cu2+：0、50、100 和200 mg/L［17-18］，Mn2+：0、0.272、1.36 和 6.8 mg/L［19-20］；取甜瓜幼葉，用于過(guò)氧化氫（H2O2）、植物激素細(xì)胞分裂素（CTK）和油菜素內(nèi)酯（BR）的 處 理，3種 處 理 濃 度 均 為 ：0、0.4、4和40 μmol/L［21］。具體方法如下，以細(xì)胞分裂素為例：配置400 mL的1/2 MS液體培養(yǎng)基，分裝在4個(gè)三角瓶中，其中3個(gè)分別加入不同濃度的細(xì)胞分裂素（0.4、4和40 μmol/L），第4個(gè)不加，作為對(duì)照。將甜瓜幼葉或根分別用70%乙醇和0.1%的HgCl2浸泡，浸泡前后均使用無(wú)菌水沖洗、晾干。將幼葉和根分別加入對(duì)應(yīng)濃度的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為2 h和36 h，無(wú)菌水沖洗、晾干，使用液氮速凍保存于-80℃超低溫冰箱中。以上每種材料均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 RNA的提取 采用TRIzol法提取已保存材料的總RNA，將材料在液氮中冷卻并迅速研磨至粉末狀，每50 mg液氮研磨的嫩葉組織加入1 mL TRIzol反復(fù)吹打，室溫放置5 min后，加入200 μL的氯仿強(qiáng)烈震蕩后，室溫條件下靜置2-3 min，4℃ 12 000 r/min低溫離心15 min，移取上清液至新的離心管中加入等量的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，再低溫離心10 min棄去上清液，1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀，低溫離心3 min棄上清，使用去RNase的滅菌水溶解沉淀，即得到甜瓜總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后，將提取的RNA置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.6 cDNA的合成 以上述提取的總RNA作為模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)體系共包括反應(yīng)1和反應(yīng)2兩個(gè)部分。反應(yīng)1主要進(jìn)行RNA的變性，反應(yīng)2進(jìn)行cDNA的合成。反應(yīng) 1體系為：取 2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、1 μg總 RNA，用去 RNase水補(bǔ)平至10 μL，混合均勻。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，2 min，4℃暫時(shí)保存。反應(yīng)2體系為：1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×Prime Script Buffer、4 μL RNase Free dH2O 與 10 μL 反 應(yīng)1混合液混合均勻。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，15 min；85℃，5 s，冰上冷卻。

1.2.7 熒光定量PCR 利用Mastercycler?ep實(shí)時(shí)熒光定量RCR儀，對(duì)樣品進(jìn)行表達(dá)特性分析。以合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR反應(yīng)體系共25 μL，其中 12.5 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，5 μmol/L的上下游引物各 2 μL，cDNA 5 μL，RNaseFree dH2O 3.5 μL。反應(yīng)過(guò)程為95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s；60℃退火20 s；65℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)結(jié)束；同時(shí)做溶解曲線分析，95℃，10 s。使用甜瓜GADPH基因作為內(nèi)參。

GADPH內(nèi)參引物序列為（上游引物：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'）；CmABCG8基因引物序列為（上游引物：5'-AAACATCGGAATGGACAAAGCC-3'，下游引物：5'-ACGAGGACGAAGTAGGCGAAAG-3'）。

2 結(jié)果

2.1 CmABCG8的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析

選取擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜中ABCG亞家族成員的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所 示，CmABCG8 與 CsABCG23、CsABCG5、CsABCG10、SlABCG19在同一支中，其中CmABCG8和CsABCG23的一致性最高。

圖1 CmABCG8和擬南芥、番茄、黃瓜、甜瓜中ABCG基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of ABCG genes in CmABCG8 and Arabidopsis thaliana，tomato（Solanum lycopersicum），cucumber（Cucumis sativus L.）and melon（Cucumis melo L.）

2.2 甜瓜ABCG家族基因表達(dá)譜熱圖

通過(guò)TBtools軟件將甜瓜ABCG亞家族在甜瓜根、莖、葉、雄蕊、雌蕊中的表達(dá)量做成熱圖（圖2），可明顯的看出甜瓜ABCG亞家族整體在雄蕊中表達(dá)量偏高，在果實(shí)中整體表達(dá)量偏低。CmABCG8在雌蕊中表達(dá)最高，在根、雄蕊、葉中表達(dá)量較高，在果實(shí)中表達(dá)量不明顯。

圖2 甜瓜ABCG基因家族在不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of ABCG gene family in the different tissues of melon

2.3 甜瓜CmABCG8蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)STRING網(wǎng)站對(duì)CmABCG8有相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CmABCD1、Pattellin-4、Ferredoxin-nitrite、Thioredoxin H2、DHN1、Tc-0109、Mildew resistance6、Sulfate transporter3.5、LOC103482955、NRT1等10個(gè) 蛋 白 直 接 與CmABCG8存在相互作用關(guān)系（圖3），結(jié)合Cytoscape軟件清晰標(biāo)注發(fā)生互作的蛋白名稱(chēng)。

圖3 甜瓜CmABCG8的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein interaction network of CmABCG8 in melon

2.4 果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期CmABCG8基因的表達(dá)特性分析

在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期，表達(dá)量如圖4所示，以0 DAP的表達(dá)量設(shè)為1，CmABCG8基因在10 DAP的表達(dá)量達(dá)到峰值，增加了1.50倍，其他時(shí)期均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，到35 DAP時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，是10 DAP時(shí)表達(dá)量的1/35 000，35 DAP后，表達(dá)量又開(kāi)始輕微上升，但極其不明顯。

圖4 甜瓜果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期CmABCG8基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of CmABCG8 gene in melon fruit at different development stages

2.5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的表達(dá)特性分析

在甜瓜不同組織中，以根的表達(dá)量設(shè)為1，莖、葉、花的表達(dá)量都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖5），基因在葉的表達(dá)量最高，為根的26倍。方差分析結(jié)果顯示，與根相比，莖、葉的表達(dá)量差異達(dá)到極顯著水平，與葉相比，莖和花的表達(dá)量差異均達(dá)極顯著水平。

圖5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expressions of CmABCG8 gene in the different tissues of melon

2.6 植物激素和H2O2處理后CmABCG8基因的表達(dá)特性分析

不同濃度的CTK、BR和H2O2處理，均會(huì)誘導(dǎo)甜瓜葉片中CmABCG8基因的表達(dá)。處理濃度為4 μmol/L時(shí)，該基因在CTK和H2O2處理組中的表達(dá)量達(dá)到最大值；處理濃度為40 μmol/L時(shí)，在BR處理中該基因表達(dá)量達(dá)最高值（圖6）。

圖6 植物激素和H2O2處理對(duì)CmABCG8基因表達(dá)特性的影響Fig.6 Effects of plant hormones and H2O2 treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

2.7 不同金屬離子處理后CmABCG8基因的表達(dá)特性分析

不同濃度的Fe2+與Cu2+處理后的甜瓜根部CmABCG8基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均呈下降趨勢(shì)，且方差分析結(jié)果（圖7）顯示，對(duì)照組與其它濃度的差異性極顯著。不同濃度Mn2+中，當(dāng)濃度達(dá)到6.8 mg/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，與對(duì)照組相比，表達(dá)量的差異性達(dá)到顯著性水平（圖7）。

圖7 不同金屬離子處理對(duì)CmABCG8基因表達(dá)特性的影響Fig.7 Effects of different metal ion treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

3 討論

近年來(lái)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在擬南芥、番茄、水稻中均有報(bào)道，認(rèn)為該蛋白能夠?qū)⑼庠炊拘晕镔|(zhì)發(fā)生螯合作用，并將其從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)入液泡，減少其對(duì)植物的傷害。隨著研究的不斷深入，植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的更多功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。ABCG作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最大的亞家族，深受廣大研究人員的關(guān)注，該亞家族成員可以通過(guò)響應(yīng)一些植物激素或植物激素前體，在植物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［22］。本文通過(guò)生物信息學(xué)和表達(dá)特性分析，來(lái)判斷甜瓜CmABCG8行使的功能。通過(guò)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖，預(yù)測(cè)到甜瓜CmABCG8與10個(gè)蛋白有相互作用，其中Dehydrin蛋白可以調(diào)控植物響應(yīng)低溫脅迫效應(yīng)［23］；Ferredoxin-nitrite蛋白參與了高等植物硝酸鹽同化還原為氨的過(guò)程［24］；Patellin蛋白具有轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的能力，能在生物膜運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中發(fā)揮功能［25］，可在植物激素和環(huán)境變化的調(diào)控下參與細(xì)胞分裂的過(guò)程［26］，煙草中的Patellin蛋白，能參與植物對(duì)病毒的防御［27］；NRT蛋白位于細(xì)胞原生質(zhì)膜上，參與NO3-從土壤中根際向植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和植株體內(nèi)NO3-在器官、組織和細(xì)胞間的再度運(yùn)輸［28］；Thioredoxin蛋白是過(guò)氧化物酶家族的一員，能夠替代金屬離子輔基所發(fā)揮的功能，清除各種過(guò)氧化物，并且植物體內(nèi)的葉綠體硫氧還原蛋白，可介導(dǎo)環(huán)境信號(hào)到葉綠體蛋白，維持植物體細(xì)胞氧化還原穩(wěn)定性，提高植物本身的抗逆性［29-31］。因此猜測(cè)CmABCG8在甜瓜中可能具有類(lèi)似這些蛋白的功能。

基因表達(dá)差異能夠揭示基因行使的功能，使用實(shí)時(shí)熒光定量的技術(shù)能夠分析出基因的作用和功能。通過(guò)不同金屬離子對(duì)甜瓜根部處理后，發(fā)現(xiàn)CmABCG8的表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，但隨著金屬離子濃度的增加，表達(dá)量有回升的趨勢(shì)，在Mn2+的濃度達(dá)到6.8 mg/L時(shí)表達(dá)量有明顯的上升，推測(cè)CmABCG8對(duì)不同的金屬離子存在劑量效應(yīng)。通過(guò)果實(shí)不同時(shí)期的表達(dá)量，得出CmABCG8基因在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量很高，而在果實(shí)發(fā)育后期不明顯，該結(jié)果與甜瓜轉(zhuǎn)錄組得到的數(shù)據(jù)完全一致，可說(shuō)明CmABCG8基因在果實(shí)發(fā)育前期發(fā)揮一些作用。通過(guò)外源H2O2和植物激素CTK、BR對(duì)甜瓜幼苗處理，表達(dá)特性結(jié)果顯示，3種處理均能大幅度影響CmABCG8基因的表達(dá)量，與對(duì)照相比，隨著濃度增加，均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，但達(dá)到一定濃度后，表達(dá)量有下降的趨勢(shì)，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組表達(dá)量。推測(cè)CmABCG8對(duì)不同植物激素的影響存在劑量效應(yīng)，除可以調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育外，還能抵抗環(huán)境壓力［32］，由本試驗(yàn)結(jié)果能看出外源植物激素能夠誘導(dǎo)CmABCG8基因的表達(dá)，是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)外源植物激素來(lái)加強(qiáng)甜瓜面對(duì)多種復(fù)雜的環(huán)境脅迫，還要繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

甜瓜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族G成員CmABCG8基因在葉中表達(dá)量顯著高于其他組織，果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)水平較高，H2O2、CTK、BR等處理均能誘導(dǎo)CmABCG8的表達(dá)，推測(cè)其可能在果實(shí)膨大期發(fā)揮重要作用，并且CmABCG8可能在甜瓜金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)和抵抗非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用。