李 媛 孫景芬 張 玲 王 揚(yáng) 李 妍

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤之一，近二十年來其發(fā)病率呈上升趨勢，占所有新發(fā)腫瘤病例的2%～3%。腎細(xì)胞癌是最常見的腎癌，大約包括85%的腎癌病例[1-2]。盡管腎細(xì)胞癌在診斷、篩查、手術(shù)和藥物治療方面取得了一定進(jìn)展，但其臨床結(jié)果仍令人不滿意[3]。因此，尋找有效的生物標(biāo)記物，特別是目前的免疫療法，將有助于提高腎細(xì)胞癌的臨床治療效果。

COL1A1是膠原蛋白家族成員之一，參與I型膠原蛋白的編碼，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和分化[4]。在成骨、骨質(zhì)疏松及骨疾病中發(fā)揮一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，包括乳腺癌和胃癌等[5]，然而，COL1A1在腎癌中的研究還不是很清楚。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫挖掘COL1A1在腎癌中的表達(dá)，并評(píng)估其對(duì)腎癌患者預(yù)后的生存價(jià)值。

材料及方法

1.腎透明細(xì)胞癌患者臨床數(shù)據(jù)的收集

UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/)[6]數(shù)據(jù)庫應(yīng)用于癌癥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，提供基于基因表達(dá)和已發(fā)布的生存信息的描述。本實(shí)驗(yàn)利用UALCAN數(shù)據(jù)獲得泛癌中COL1A1的表達(dá)水平。通過在線TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov/)[7]獲取腎透明細(xì)胞癌患者基因表達(dá)及生存預(yù)后的數(shù)據(jù)。所有明確診斷為腎透明細(xì)胞癌的患者均被納入統(tǒng)計(jì)分析，腎透明細(xì)胞癌患者癌組織標(biāo)本539例，癌旁組織標(biāo)本72例。

2.COL1A1與免疫浸潤的關(guān)系

從TIMER2.0數(shù)據(jù)庫獲得腎透明細(xì)胞癌中COL1A1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系數(shù)據(jù)。TIMER2.0是分析不同類型癌癥免疫浸潤的綜合數(shù)據(jù)庫(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)[8-9]。從基因表達(dá)譜推斷腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(TIICs)的峰度值。TIMER數(shù)據(jù)庫包括來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的32種癌癥類型的10897個(gè)樣本，以估計(jì)免疫浸潤的峰度。我們利用基因模塊分析了COL1A1在KIRC中的表達(dá)，并分析了COL1A1表達(dá)與免疫浸潤(包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞及NK細(xì)胞)峰度的關(guān)系?？鼓[瘤純度的基因表達(dá)水平借鑒已有文獻(xiàn)[10-11]。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在R語言安裝ggplot2包的條件下，分析COL1A1在腎透明細(xì)胞癌患者中的表達(dá)情況，survival包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析[7]。log-rank檢驗(yàn)[12]分析各組的生存時(shí)間分布差異；卡方檢驗(yàn)分析COL1A1與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理分組的關(guān)系。P<0.05視為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.COL1A1在泛癌中的表達(dá)情況

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得COL1A1在泛癌中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示COL1A1在乳腺癌、膽管癌、胃癌、肺腺癌及腎癌等患者中高表達(dá)，在宮頸癌、胸腺瘤及子宮內(nèi)膜癌中呈低表達(dá)狀態(tài)(圖1)。

2.COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

為了探討COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中的作用，利用TCGA數(shù)據(jù)庫獲得COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，相比健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2)。

圖1 COL1A1在泛癌中的表達(dá)

圖2 COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)

3.腎透明細(xì)胞癌患者COL1A1的表達(dá)對(duì)生存預(yù)后的影響

為探討腎透明細(xì)胞癌患者COL1A1的表達(dá)水平與生存預(yù)后的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選取了20年生存期的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，高表達(dá)COL1A1腎透明細(xì)胞癌患者相比低表達(dá)COL1A1患者具有更好的臨床預(yù)后，即COL1A1的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者20年的預(yù)后生存率相關(guān)(P=0.001，圖3)。

圖3 COL1A1的表達(dá)水平與總生存期的相關(guān)性

log-rank的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，腎透明細(xì)胞癌患者的生存時(shí)間分布和正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 生存時(shí)間分布統(tǒng)計(jì)表

對(duì)于預(yù)后的單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，COL1A1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后診斷具有一定的預(yù)測價(jià)值(表2)。

表2 單因素Cox回歸分析結(jié)果

4.COL1A1表達(dá)與臨床病理分組的相關(guān)性

從數(shù)據(jù)庫中獲得的臨床病理數(shù)據(jù)，其中高表達(dá)COL1A1患者270例，低表達(dá)COL1A1患者269例。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，COL1A1的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的T分期、N分期及年齡存在一定的相關(guān)性(P<0.05)，與腎透明細(xì)胞癌的M分期無明顯相關(guān)性(P>0.05，表3)。

表3 COL1A1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

5.COL1A1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，1年生存期AUC=0.631，2年生存期AUC=0.589，3年生存期AUC=0.570，表明COL1A1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷具有一定的臨床價(jià)值(圖4)。

圖4 COL1A1的ROC曲線

6.腎透明細(xì)胞癌患者COL1A1的表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系

腫瘤浸潤免疫細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。抗腫癌純度的基因表達(dá)水平如圖5所示。腎透明細(xì)胞癌中COL1A1與CD4細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，與B細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CD8表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)(圖5)。

圖5 COL1A1的表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系

討 論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Ⅰ型膠原蛋白含量豐富，是由2條COL1A1基因編碼的α1鏈和1條COL1A2基因編碼的α2鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)。I型膠原纖維主要參與形成細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的粘附及分化有重要作用，由于腫瘤細(xì)胞間的粘附作用普遍降低，因此促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移[13]。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1參與了谷氨酰胺介導(dǎo)的胰腺癌與星狀細(xì)胞的相互作用[14]。沉默COL1A1的表達(dá)可以抑制小鼠結(jié)直腸腫瘤的原位生長[15]。另外，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾COL1A1的表達(dá)抑制了肝癌的克隆、侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。這些研究表明，COL1A1在多種腫瘤的形成及代謝中發(fā)揮重要作用。然而，COL1A1在腎癌中的研究甚少。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在mRNA水平上，與癌旁組織相比，COL1A1在腎透明細(xì)胞癌中呈明顯高表達(dá)狀態(tài)(P<0.05)，其表達(dá)水平與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。Cox回歸分析和ROC曲線結(jié)果提示，COL1A1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后診斷具有預(yù)測價(jià)值。COL1A1的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的T分期、N分期及年齡存在一定的相關(guān)性。表明COL1A1對(duì)腎透明細(xì)胞癌的臨床診斷及預(yù)后評(píng)估具有一定的臨床價(jià)值，是否能作為診斷標(biāo)志物還有待進(jìn)一步分析。

免疫反應(yīng)與臨床預(yù)后密切相關(guān)，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(TIIC)形成一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的進(jìn)展有調(diào)節(jié)作用，TIIC對(duì)于腫瘤的預(yù)后研究具有一定的價(jià)值。細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和CD4+輔助T細(xì)胞可以靶向腫瘤抗原細(xì)胞抑制腫瘤生長。CD4+T細(xì)胞浸潤后可以通過TGFβ1/YBX1/HIF2α信號(hào)調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖[17]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是腫瘤淋巴結(jié)狀態(tài)和生存的獨(dú)立預(yù)測因子[18]。微環(huán)境基質(zhì)中的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞參與了多種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的功能。本研究應(yīng)用TIMER2.0評(píng)估了腎透明細(xì)胞癌中COL1A1表達(dá)與免疫浸潤水平之間的關(guān)系。通過分析發(fā)現(xiàn)，COL1A1表達(dá)與腫瘤純度呈顯著負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DC細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤水平呈顯著正相關(guān)，與B細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，但與CD8+T細(xì)胞浸潤水平無顯著相關(guān)性。

因此，本研究得出結(jié)論，低表達(dá)COL1A1的腎透明細(xì)胞癌患者具有較好的臨床預(yù)后。COL1A1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平有關(guān)。這一結(jié)果為尋找腎透明細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)確定提供一定的理論依據(jù)。