苗金魚，何麗彩，劉 媛，張建鋒，王春艷，王敬然，丁秋蕾,邊浩鵬

1.石家莊市人民醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050000;2.河北省優(yōu)撫醫(yī)院外一科，河北石家莊 050000;3.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院普外科，河北石家莊 050000;4.石家莊市人民醫(yī)院腫瘤科，河北石家莊 050000;5.石家莊市人民醫(yī)院普外科，河北石家莊 050000

結(jié)直腸癌(CRC)是當今世界上第四大致命癌癥，每年有近90萬人死于CRC，并且CRC的發(fā)病率有逐年升高的趨勢[1]。目前，CRC的治療以手術(shù)治療、輔助或新輔助化療及放療為主，但對于晚期轉(zhuǎn)移性患者，即使積極進行綜合治療，其預(yù)后仍較差[2]。深入研究CRC的發(fā)生機制，尋找新的CRC標志物，對于CRC的早期診斷、個體化治療的選擇和預(yù)后預(yù)測具有重要的臨床價值。鈣離子結(jié)合蛋白14(S100A14)、鈣離子結(jié)合蛋白16(S100A16)均屬于S100鈣離子結(jié)合蛋白家族成員，均位于人類一號染色體，具有典型的EF-手型鈣離子結(jié)合基序，以同源二聚體或異源二聚體復(fù)合物形式發(fā)揮功能[3]。S100A14 、S100A16參與多種調(diào)控機制和途徑，通過與自分泌的酶、受體、細胞骨架、轉(zhuǎn)錄因子和核酸相互作用，影響鈣穩(wěn)態(tài)、代謝、增殖、凋亡、遷移、分化、炎癥等生理、病理學過程[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，S100A14、S100A16參與乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，影響腫瘤細胞遷移和侵襲、細胞生長和細胞死亡、腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用等生理、病理過程[5-6]。有研究報道，腫瘤細胞中S100A14與S100A16之間存在相互協(xié)同作用，共同參與腫瘤的惡性進展[7]。由于S100A14通過激活趨化因子配體2，促進腫瘤轉(zhuǎn)移，CRC中也存在趨化因子配體2激活的現(xiàn)象，推測S100A14在CRC中可通過相似機制發(fā)揮作用[5,8]。本研究通過檢測CRC組織中S100A14、S100A16的表達情況，并探討兩者與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以期明確S100A14、S100A16在CRC中表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年2月石家莊市人民醫(yī)院(下稱本院)收治的136例CRC患者為研究對象。其中男82例，女54例；年齡39～78歲，平均(68.52±8.27)歲；腫瘤位置：直腸54例，結(jié)腸82例；病理類型：黏液腺癌及其他33例，管狀腺癌103例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期103例，Ⅲ期33例；腫瘤分化程度：高、中分化94例，低分化42例；腫瘤大?。骸? cm者55例，>4 cm者81例。納入標準：(1)術(shù)后病理檢查確診為CRC；(2)初次診治；(3)一般健康狀況良好，卡氏評分>70分；(4)具備手術(shù)指征，均完成CRC根治術(shù)。排除標準：(1)伴心肺功能衰竭；(2)臨床資料不完整；(3)伴嚴重心腦血管疾病或精神障礙疾病。患者及其家屬均知情同意本研究并已簽署同意書，本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2免疫組織化學法檢測 將手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上)用10%中性甲醛固定過夜，石蠟包埋組織后切片機切片，60 ℃烤片2 h；二甲苯脫蠟兩遍；梯度乙醇水化；高壓鍋法檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原熱修復(fù)；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min；封閉液封閉2 h；兔抗人多克隆抗體37 ℃孵育2 h，S100A14、S100A16一抗稀釋比1∶500，抗體購自英國Abcam公司，貨號：ab251779、ab130419；山羊抗兔二抗孵育1 h；辣根過氧化物酶標記三抗孵育1 h；DAB顯色；蘇木素復(fù)染5 min；梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后，倒置顯微鏡400倍下觀察(型號：CKX53，廠家：日本奧林巴斯株式會社)。免疫組化染色結(jié)果用染色面積評分乘以染色強度評分表示，由兩位病理科醫(yī)師共同閱片診斷并打分。染色面積：無染色為0分，染色面積<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，褐色為3分。二者乘積小于3分為陰性，大于等于3分判定為陽性[9]。

1.3隨訪 所有患者自出院開始進行隨訪，以電話或者門診復(fù)查方式進行隨訪，隨訪截至2021年2月。隨訪終點為患者死亡或隨訪結(jié)束。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以Spearman秩相關(guān)分析S100A14與S100A16表達的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析不同S100A14、S100A16表達情況CRC患者的生存情況。COX比例風險回歸分析影響CRC患者預(yù)后的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1CRC組織及癌旁組織中S100A14、S100A16表達 CRC組織中S100A14、S100A16陽性表達率明顯低于癌旁組織中S100A14、S100A16的陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CRC組織及癌旁組織中S100A14、S100A16表達[n(%)]

2.2CRC組織中S100A14、S100A16表達的相關(guān)性 利用Spearman秩相關(guān)分析CRC中S100A14、S100A16表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示S100A14與S100A16表達呈正相關(guān)(r=0.595,P<0.001)。

2.3CRC組織中S100A14、S100A16表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CRC組織中S100A14、S100A16表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、病理類型和腫瘤位置、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 CRC組織中S100A14、S100A16表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.4CRC組織中不同S100A14、S100A16表達患者生存預(yù)后比較 136例CRC患者中，失訪2例，死亡40例，存活94例，3年生存率為70.15%(94/134)。S100A14陽性表達患者41例，死亡5例，3年生存率為87.80%(36/41)；S100A14陰性表達患者93例，死亡35例，3年生存率為62.37%(58/93)。S100A14陰性表達患者3年生存率明顯低于陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.532，P=0.011)。S100A16陽性表達患者37例，死亡4例，3年生存率為89.19%(33/37)；S100A16陰性表達患者97例，死亡36例，3年生存率為62.89%(61/97)。S100A16陰性表達患者3年生存率明顯低于陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.270，P=0.007)。見圖1。

圖1 不同S100A14、S100A16表達情況CRC患者的生存曲線

2.5COX比例風險回歸分析影響CRC患者預(yù)后的危險因素 以CRC患者為樣本，建立COX比例風險回歸模型。以CRC患者的生存預(yù)后為因變量(賦值：1=死亡，0=生存，t=生存時間)，自變量包括CRC患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、腫瘤位置、腫瘤分化程度、TNM分期、S100A14、S100A16，分析結(jié)果表明TNM分期Ⅲ期、S100A14陰性、S100A16陰性是影響CRC患者預(yù)后的危險因素(P<0.05，HR>1)。見表3。

表3 影響CRC患者預(yù)后的Cox比例風險回歸分析

3 討 論

CRC約占全世界每年診斷的癌癥和癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的10%，它是女性中第二常見的癌癥，男性中第三常見的癌癥[1]。多種因素均能夠增加CRC的發(fā)病風險，包括人口老齡化、炎性腸病及家族遺傳病史等，吸煙、飲酒等不良生活方式也影響CRC的發(fā)生[10]。深入探索CRC的疾病機制，尋找CRC預(yù)后判斷的腫瘤標志物具有重要意義。目前認為，CRC的發(fā)生與染色體不穩(wěn)定性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和CpG島甲基化有關(guān)，涉及促癌基因如原癌基因KRAS、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)等的過度激活和抑癌基因APC、TP53等的失活。例如APC突變導致β-連環(huán)蛋白易位到細胞核并驅(qū)動與腫瘤發(fā)生和侵襲有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄[11]，而 KRAS 和PI3K的突變導致MAP激酶的持續(xù)激活，從而促使細胞增殖[12]。因此，尋找影響CRC發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵驅(qū)動基因的表達變化，有利于CRC的預(yù)后判斷。

S100家族蛋白由 21 種不同的亞型組成，包括S100A、S100B、S100P及S100Z。17 種 S100A亞家族蛋白(包括 S100A14、S100A16等)位于染色體 1q21 上的2Mb區(qū)域內(nèi)[4]。大多數(shù)S100家族蛋白能夠通過影響晚期糖基化終產(chǎn)物受體、表皮生長因子受體通路和p53通路，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用[13-14]。S100A14蛋白編碼基因包含2 165個堿基，編碼104個氨基酸，主要表達在結(jié)直腸黏膜、胃、卵巢及輸卵管等組織[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A14在乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中異常表達，并能夠促進腫瘤的增殖[5,15]。本研究中，CRC組織中S100A14的表達顯著下調(diào)。目前CRC中調(diào)控S100A14表達的機制尚不清楚。ZHANG等[16]學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中S100A14的表達受到非編碼RNA如微小RNA-153-5p的調(diào)控，微小RNA-153-5p的表達能夠降低S100A14 mRNA的穩(wěn)定性，抑制其表達。HE等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在CRC中miR-153-5p能夠通過抑制抑癌基因Bcl-2的表達，促進腫瘤細胞耐藥性的形成，導致腫瘤進展。推測CRC中S100A4可能是新的miR-153-5p下游靶點，值得深入研究。本研究結(jié)果顯示，S100A14的表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)，表明CRC中S100A14的表達下調(diào)促進腫瘤的進展。SAPKOTA等[18]學者報道，S100A14能誘導腫瘤細胞G1期阻滯，S100A14表達降低后，其G1期阻滯能力降低，促進口腔鱗癌細胞的增殖，并且腫瘤抑制蛋白p53的功能發(fā)揮也依賴于S100A14，敲低腫瘤細胞中S100A14的表達，p53的抑癌能力也顯著下調(diào)。進一步研究S100A14對CRC患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示S100A14陰性表達的CRC患者預(yù)后較差，且S100A14陰性表達是CRC患者不良預(yù)后的危險因素，表明S100A14可用于CRC的預(yù)后判斷。

S100A16是S100鈣結(jié)合蛋白家族成員，參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶、Notch和核因子κB通路等，并參與染色體重排，與宮頸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和進展密切相關(guān)[19-20]。本研究中，CRC組織中S100A16表達降低，可能與CRC中S100A16的表觀遺傳學修飾有關(guān)。研究表明，S100A16基因啟動子區(qū)域的CpG島的高甲基化狀態(tài)，誘導S100A16基因的表達沉默，負性調(diào)控S100A16表達[21]。本研究中，CRC組織中S100A16的表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)。提示S100A16的表達降低促進CRC的發(fā)生、發(fā)展。有文獻報道[22]，S100A16一方面通過抑制JNK/p38 MAPK 信號通路的激活進而抑制腫瘤細胞的增殖，另一方面，S100A16通過抑制腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲等惡性生物學行為[7]。此外，ZHANG等[23]發(fā)現(xiàn)，S100A16通過PI3K/AKT通路抑制白血病細胞的細胞增殖，S100A16的低表達與成人B細胞急性淋巴細胞白血病較高的復(fù)發(fā)率和較短的無復(fù)發(fā)存活時間相關(guān)。本研究中，S100A16陰性表達的CRC患者預(yù)后較差，亦表明檢測CRC組織中S100A16的表達有助于患者的預(yù)后判斷。

本研究中，CRC中S100A14與S100A16的表達呈正相關(guān)，表明其在CRC的發(fā)生、發(fā)展中可能存在相互協(xié)同的生物學功能。TANAKA等[24]學者在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，S100A14與S100A16在細胞內(nèi)空間分布上，均以鈣非依賴性方式結(jié)合定位于細胞質(zhì)和細胞膜中的肌動蛋白上，兩者之間的相互協(xié)同作用促進細胞骨架動力學的變化，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。但目前CRC中兩者的具體作用機制有待深入探索。

綜上所述，CRC組織中S100A14、S100A16表達降低，兩者表達呈正相關(guān)。S100A14、S100A16表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)，兩者共同促進CRC的惡性發(fā)展。此外，TNM分期Ⅲ期、S100A14陰性、S100A16陰性是影響CRC患者預(yù)后的危險因素。S100A14、S100A16可用于評估CRC患者生存預(yù)后，值得臨床深入探索。