陳雪禮，薛國(guó)輝，華 琳，劉曉峰，李觀華，張啟貴，晏慧民

九江市第一人醫(yī)院：1．檢驗(yàn)科；2．腎內(nèi)科，江西九江 332000

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)性血管炎(AAV)是寡免疫復(fù)合物沉積介導(dǎo)的免疫性壞死性血管炎[1-2]，患者存在不可逆器官損傷的風(fēng)險(xiǎn)[3]。AAV的疾病活動(dòng)度不僅影響治療方案的選擇，還提示了疾病的復(fù)發(fā)率或難治性，因而準(zhǔn)確地定義AAV的活動(dòng)度非常重要。目前，伯明翰血管炎活動(dòng)性評(píng)分(BVAS)、醫(yī)師全局評(píng)估、疾病程度指數(shù)和五因素評(píng)分(FFS)等可用于評(píng)估 AAV 疾病活動(dòng)性[4-6]。但這些指標(biāo)的主觀性和復(fù)雜性使其難以應(yīng)用于臨床實(shí)踐，因而發(fā)掘新的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)志物至關(guān)重要[7]。此外，AAV的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。已有證據(jù)表明靶向與 CD4+T 輔助細(xì)胞亞群分化相關(guān)的細(xì)胞因子可有效改善抗髓過(guò)氧化物酶抗體(MPO)腎小球腎炎[8]。其中T淋巴細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(IL-8)和CXCL-1的分泌，而這些細(xì)胞因子可促進(jìn)ANCA靶抗原的表達(dá)。而在抗MPO腎小球腎炎動(dòng)物模型中，IL-17缺陷發(fā)揮保護(hù)作用[9]。這些研究均表明Th17參與了AAV的致病機(jī)制，但其調(diào)控機(jī)制不明。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子1A (TL1A)可調(diào)控Th17分化[10]，據(jù)此本文推測(cè)TL1A可能在AAV中發(fā)揮作用，但報(bào)道甚少。本研究將通過(guò)分析AAV患者TL1A的表達(dá)變化及其與Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和臨床參數(shù)間的關(guān)系，為AAV的發(fā)病機(jī)制研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2022年2月于本院就診并確診為AAV的患者51例為AAV組，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于AAV的分類標(biāo)準(zhǔn)及2012年Chapel Hill 共識(shí)會(huì)議關(guān)于AAV的定義[11-12]。另選取同期于本院體檢中心行健康檢查的50例體檢健康者作為對(duì)照組。兩組人群年齡和性別構(gòu)成比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入的AAV病例中MPO-AAV 42例，蛋白酶-3(PR-3)-AAV 9例。所有患者均被告知本研究的目的、并簽署知情同意書，研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。AAV病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)AAV初診患者；(2)納入研究前6個(gè)月內(nèi)無(wú)激素使用史；(3)無(wú)感染、重大心血管疾病、過(guò)敏性疾病、腫瘤及其他自身免疫性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非初診患者；(2)就診前6個(gè)月內(nèi)使用過(guò)免疫抑制劑或非甾體抗炎藥等藥物；(3)既往和當(dāng)前合并急慢性感染、免疫性疾病及腫瘤等疾病。記錄AAV患者的活動(dòng)度評(píng)分即2003版伯明翰血管炎評(píng)分(BVAS-2003)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

1.2標(biāo)本采集及處理 抽取所有受試者清晨空腹靜脈血4 mL，其中2 mL分裝于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。另2 mL靜脈血分裝于干燥管中，4 000 r/min，離心10 min分離血清并于-80 ℃冰箱保存，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞 用RPMI 1640調(diào)整PBMC濃度至2.0×106/mL，接種于6孔板中，加入25 ng/mL佛波酯、500 ng/mL離子霉素及1.7 μg/mL莫能霉素，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后取出細(xì)胞加入抗CD3和CD4抗體各10 μL，充分混勻后室溫避光孵育20 min，用PBS 清洗2次后，1 200 r/min離心去上清液，加入固定劑固定15 min，PBS清洗1次后離心去上清液，加入破膜劑室溫孵育5 min離心去上清液。加入抗IL-17抗體10 μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500 μL PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)。圈定CD3+CD4+細(xì)胞群，進(jìn)一步分析 Th17細(xì)胞群，其表型定義為CD3+CD4+IL-17+。

1.4ELISA測(cè)定血清TL1A、IL-17和IL-23的水平 血清TL1A、IL-17和IL-23測(cè)定均采用ELISA法，所需試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，分別為Human TL1A/TNFSF15 DuoSet ELISA(DY1319-05)、Human IL-17 Quantikine ELISA Kit(D1700)和Human IL-23 Quantikine ELISA Kit(M2300)，所有步驟均嚴(yán)格參照試劑盒操作說(shuō)明書執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1納入患者的基線特征 納入研究的AAV患者基線資料見(jiàn)表1。平均年齡為(53.17±16.89)歲，其中男16例(31.37%)。15例為肉芽腫性多血管炎、26例為顯微鏡下多血管炎和10例嗜酸性肉芽腫性多血管炎。在臨床表現(xiàn)中，腎臟表現(xiàn)是最常見(jiàn)的(82.35%)，其次是肺部(68.63%)和系統(tǒng)性(41.18%)表現(xiàn)。AAV患者BVAS-2003疾病活動(dòng)度評(píng)分為(16.32±7.81)分。

表1 納入的AAV患者臨床基線特征

2.2AAV組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室一般資料比較 與對(duì)照組相比，AAV組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEU)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)和C反應(yīng)蛋白(CRP)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。此外，AAV組相較對(duì)照組具有更低水平的血紅蛋白濃度(Hb)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、血清清蛋白(ALB)和腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AAV組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室一般資料比較

2.3AAV患者血清TL1A、Th17、IL-17及IL-23的變化 ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AAV組具有更高水平血清IL-17(5.67±2.16vs.2.72±1.34)、IL-23(12.12±4.91vs.7.14±2.93)和TL1A(22.52±7.72vs.10.16±4.45)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Th17細(xì)胞頻率在AAV患者中同樣顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 AAV患者血清的變化注：A為IL-17；B為IL-23；C為TL1A；D、E為Th17。

2.4TL1A與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及活動(dòng)度評(píng)分BVAS-2003的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示AAV患者中血清TL1A與血清IL-17、Th17頻率、CRP及BVAS-2003均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。而與GFR呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。與其他指標(biāo)間的相關(guān)性并不顯著(均P>0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 TL1A與IL-17、Th17、CRP、BVAS-2003及GFR間的相關(guān)性

2.5以BVAS-2003為標(biāo)準(zhǔn)繪制血清TL1A的ROC曲線 BVAS 評(píng)分總分15 分以上為活動(dòng)期，反之則為緩解期，本研究中活動(dòng)期患者22例，緩解期患者30例。據(jù)此繪制TL1A預(yù)測(cè)疾病活動(dòng)期的ROC曲線，血清TL1A預(yù)測(cè)AAV疾病活動(dòng)期具有較好的價(jià)值，其曲線下面積(AUC)高達(dá)0.87(95%CI：0.775 9～0.966 3，P<0.001)，最佳cut off值為19.95 ng/mL，靈敏度為90.48%，特異度為72.41%。并與IL-17、IL-23、Th17及CRP進(jìn)行比較，TL1A預(yù)測(cè)AAV疾病活動(dòng)期的AUC最大，見(jiàn)圖3。

圖3 血清TL1A、IL-17、IL-23、Th17及CRP預(yù)測(cè)AAV活動(dòng)性的ROC曲線

3 討 論

在臨床實(shí)踐中，急性期反應(yīng)物如CRP和 ANCA 滴度是評(píng)估當(dāng)前 AAV 活動(dòng)度的最常見(jiàn)的生物標(biāo)志物[15]。然而，由于這些實(shí)驗(yàn)室變量的低特異性，需要新的和便捷的替代生物標(biāo)志物來(lái)更加準(zhǔn)確地評(píng)估AAV 的疾病活動(dòng)性。目前，研究證實(shí)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在AAV發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AAV 患者腎臟活檢組織中可見(jiàn)大量T 細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽腫組織亦可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[16]。其T 細(xì)胞處于持續(xù)的活化狀態(tài)，激活的T 細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞毒效應(yīng)、聚集和激活巨噬細(xì)胞等多種途徑而引起組織損傷[8]。AAV 患者的Th17細(xì)胞及相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子異常上調(diào)，這可能是引起AAV炎癥產(chǎn)生的重要原因。以往研究顯示在AAV患者中產(chǎn)生IL-17的淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，活動(dòng)期血清IL-17水平更高[17]。此外，在AAV患者的腎小球和腎間質(zhì)中觀察到IL-17陽(yáng)性細(xì)胞存在，并證實(shí)AAV患者的腎組織中IL-17 mRNA表達(dá)增加[18]。近期越來(lái)越多的證據(jù)表明Th17活化在 AAV 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。作為Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，TL1A在多種自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性腸病、原發(fā)性膽汁性肝硬化和銀屑病中均已被證實(shí)顯著升高并與疾病活動(dòng)相關(guān)[19]，但其在AAV患者中如何變化，并不清楚。

在本研究中，血清TL1A水平在AAV患者中顯著升高，與 BVAS-2003顯著相關(guān)。此外，血清TL1A與Th17細(xì)胞及其相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子亦存在顯著正相關(guān)性，提示其可能在AAV中扮演調(diào)控Th17細(xì)胞的角色。SUN等[20]發(fā)現(xiàn)在與骨關(guān)節(jié)炎患者和健康對(duì)照者相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中TL1A水平顯著升高，且血清水平與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性自身抗體相關(guān)，包括類風(fēng)濕因子和抗瓜氨酸蛋白抗體。且TL1A刺激后來(lái)自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體顯著升高。但該研究并未發(fā)現(xiàn)血清TL1A 水平與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)之間的相關(guān)性。值得注意的是，本研究中的ROC曲線結(jié)果顯示血清TL1A水平預(yù)測(cè)AAV患者疾病活動(dòng)度具備較好的性能，可能是評(píng)估 AAV 疾病活動(dòng)的潛在生物標(biāo)志物。血清TL1A水平與AAV 疾病活動(dòng)之間的顯著關(guān)聯(lián)在理論上可能是因?yàn)門L1A可以由活化的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌[21]，而這些細(xì)胞在AAV的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志物在AAV患者血清中升高。此外，ANCA的IgG亞型主要由IgG1和IgG4組成，提示需要T 細(xì)胞參與ANCA的同種型轉(zhuǎn)換[22]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)T細(xì)胞浸潤(rùn)及活化與AAV相關(guān)，并最終導(dǎo)致終末期腎臟病，而巨噬細(xì)胞可能會(huì)在血管炎靶組織中積聚，并在急性炎癥消退后的損傷反應(yīng)階段引起 AAV 中的器官損傷[23-24]。這些結(jié)果支持血清TL1A可能是評(píng)估AAV活性的生物標(biāo)志物的證據(jù)。其次，由于血管損傷，內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌血清TL1A。有研究表明AAV中血管損傷和血管生成的循環(huán)分子水平顯著增加[24]。因此，推測(cè)當(dāng)發(fā)生廣泛的血管損傷和血管生成時(shí)，血清TL1A水平會(huì)上調(diào)?；蛘撸琓L1A也可能通過(guò)增加趨化性、細(xì)胞黏附和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移與AAV炎癥直接相關(guān)，從而導(dǎo)致血管損傷增加。有研究表明，TL1A在同為廣泛血管損傷的川崎病患者中顯著上調(diào)[25]，這也間接支持這一假說(shuō)。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)血清TL1A在AAV患者中異常上調(diào)，且與同樣升高的Th17細(xì)胞密切相關(guān)。此外，與BVAS-2003的顯著相關(guān)性及ROC曲線結(jié)果表明血清TL1A可能成為AAV患者疾病活動(dòng)度評(píng)價(jià)的新的生物標(biāo)志物。當(dāng)然，這有必要在未來(lái)的研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證，且需利用TL1A敲除的動(dòng)物模型探究TL1A參與AAV發(fā)病過(guò)程的分子機(jī)制。