張省委,林 博,韓 冉,張萬(wàn)宇

北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100078

慢性乙型肝炎(HBV)是臨床常見(jiàn)的傳染病之一，隨著疾病的進(jìn)一步進(jìn)展，可逐步發(fā)展為肝硬化、肝癌以及終末期肝病[1]。目前，臨床通過(guò)對(duì)慢性HBV患者的抗病毒治療，可顯著降低疾病的進(jìn)展。常見(jiàn)的抗病毒治療藥物主要包括干擾素以及核苷酸類似物，臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)慢性HBV患者采取干擾素治療，可獲得較高的乙型肝炎E抗原(HBeAg)以及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清轉(zhuǎn)換率[2]，但是具有較高的不良反應(yīng)，同時(shí)其較高的價(jià)格導(dǎo)致患者的依存性較低[3]。微小核苷酸主要存在于真核細(xì)胞生物以及病毒中。有研究報(bào)道顯示，miR-125b-5p、miR-122-3p不僅對(duì)于乙型肝炎的診斷具有積極的意義，同時(shí)在一定程度上對(duì)HBV的耐藥性判斷具有一定價(jià)值[3]。本文主要通過(guò)研究miR-125b-5p、miR-122-3p的表達(dá)水平，來(lái)探討其與HBV患者肝功能、免疫功能的關(guān)系，同時(shí)對(duì)治療效果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為臨床診斷以及治療效果監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本文采取前瞻性研究，選擇2019年1月至2021年1月在本院進(jìn)行HBV治療的120例患者為病例組，其中男66例，女54例；年齡39～59歲，平均(44.72±2.37)歲，病程2～4年，平均(3.01±0.22)年；平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.11±2.09)kg/m2。HBV的診斷參考《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[4]中對(duì)病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)滿足上述診斷者；(2)入組前2周未使用抗病毒或免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)對(duì)本研究藥物過(guò)敏患者；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)自身免疫性疾病患者；(4)精神障礙患者；(5)嚴(yán)重的心、腦、腎功能障礙患者；(6)惡性腫瘤患者。另選取同期體檢健康者120例作為對(duì)照組，其中男60例，女60例，年齡38～57歲，平均(44.82±1.89)歲；平均BMI為(24.01±1.99)kg/m2，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBV陽(yáng)性指標(biāo)者；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)自身免疫性疾病；(4)精神障礙患者；(5)嚴(yán)重的心、腦、腎功能障礙患者；(6)惡性腫瘤患者。兩組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)論證通過(guò)。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者均采取富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(成都倍特藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字： H20163436,每日1次，每次300 mg)聯(lián)合恩替卡韋(安徽貝克生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019；每日1次，每次0.25 mg)治療，共治療6個(gè)月。治療結(jié)束后每3個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪，隨訪結(jié)束日期為2021年11月1日。隨訪指標(biāo)包括肝功能檢測(cè)、HBV-DNA、HBsAg和乙型肝炎表面抗體(HBsAb)的檢測(cè),根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)術(shù)后HBV復(fù)發(fā)率?；颊叩闹委熜Чu(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：治療后患者的肝功能指標(biāo)恢復(fù)正常狀態(tài)，HBV-DNA含量下降到<1 000 copy/mL則為顯效；治療后患者的肝功能指標(biāo)明顯恢復(fù)，HBV-DNA含量較治療前降低值>2 000 copy/mL則為有效；治療后患者的肝功能指標(biāo)無(wú)顯著變化，與治療前相比，HBV-DNA含量降低值<2 000 copy/mL則為無(wú)效。本研究中以120例HBV治療患者中顯效以及有效作為治療有效組，以無(wú)效作為治療無(wú)效組[5]。

1.2.2miR-125b-5p、miR-122-3p檢測(cè) 分別于治療前以及治療6個(gè)月后進(jìn)行靜脈采血4 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，以Trizol試劑(TIANGEN,中國(guó))進(jìn)行總RNA提取，采用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行擴(kuò)增，miR-125b-5p上游引物：5′-TTA TTG GGT GTT GTA TT-3′，miR-125b-5p下游引物：5′-TTG TAG GGT TTG AGG TAT TT-3′，miR-122-3p上游引物：5′-GTA TTG GAT ATG ATT GAT TAT G-3′，miR-122-3p下游引物：5′-TAG TGT AGG GTT TGA GG-3′，以U6作為內(nèi)參基因，U6上游引物，5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃下5 min，95 ℃下40 s，60 ℃下20 s，72 ℃下15 s，共計(jì)完成40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt計(jì)算miR-125b-5p、miR-122-3p水平，ΔCt=各組目的基因Ct值-組內(nèi)相應(yīng)內(nèi)參的Ct值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)ΔCt-對(duì)照ΔCt。

1.2.3肝功能檢測(cè) 采集所有患者靜脈血4 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀combas701檢測(cè)肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平。ALT、AST和AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

1.2.4免疫指標(biāo)檢測(cè) 使用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)對(duì)兩組患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平進(jìn)行檢測(cè)；使用全自動(dòng)免疫分析儀combas801對(duì)兩組患者的IgA、IgM、IgG進(jìn)行檢測(cè)。CD3+、CD4+、CD8+抗體購(gòu)于賽默飛世爾公司；IgA、IgM、IgG檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

2 結(jié) 果

2.1病例組與對(duì)照組的miR-125b-5p、miR-122-3p水平比較 病例組miR-125b-5p、miR-122-3p水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組miR-125b-5p、miR-122-3p水平比較

2.2病例組與對(duì)照組的肝功能比較 病例組TBIL、ALT、AST均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 病例組與對(duì)照組的肝功能比較

2.3病例組與對(duì)照組的免疫功能比較 病例組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 病例組與對(duì)照組的免疫功能比較

2.4不同治療效果的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比較 經(jīng)過(guò)富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯(lián)合恩替卡韋治療后，無(wú)效組的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平均顯著高于有效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同治療效果患者的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比較

2.5不同治療效果患者的肝功能比較 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯(lián)合恩替卡韋治療后，無(wú)效組患者的TBIL、ALT、AST顯著高于有效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同治療效果患者的肝功能比較

2.6不同治療效果患者的免疫功能比較 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯(lián)合恩替卡韋治療后，無(wú)效組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG顯著低于有效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 不同效果患者的免疫功能比較

2.7相關(guān)性分析 通過(guò)對(duì)病例組miR-125b-5p、miR-122-3p與肝功能、免疫功能相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p、miR-122-3p與TBIL、ALT、AST、HBV DNA呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表7。

表7 相關(guān)性分析

2.8miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值分析 miR-125b-5p、miR-122-3p對(duì)于患者治療無(wú)效預(yù)測(cè)的特異度顯著高于單獨(dú)檢測(cè)，且經(jīng)ROC曲線分析，兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于無(wú)效患者的預(yù)測(cè)ROC曲線下面積顯著高于單獨(dú)檢測(cè)，且miR-125b-5p、miR-122-3p最佳臨界值分別為2.41，2.55(2-ΔΔCt)。見(jiàn)表8和圖1。

表8 miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值分析

圖1 ROC曲線分析

3 討 論

人體感染HBV后，microRNA可受到損傷，分解后進(jìn)入血液循環(huán)，其形態(tài)較為穩(wěn)定[6]。有研究顯示，microRNA參與了肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，因此檢測(cè)HBV患者的microRNA，對(duì)于探索疾病進(jìn)展以及治療效果具有積極的意義[7]。

在本研究中，通過(guò)對(duì)HBV患者的miR-125b-5p、miR-122-3p水平分析，發(fā)現(xiàn)HBV患者體內(nèi)miR-125b-5p、miR-122-3p水平高于健康人群，且隨著HBV患者治療效果的好轉(zhuǎn)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。miR-122-3p主要來(lái)源于人體的18號(hào)染色體。研究證明[8]，miR-122-3p在HBV感染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，在huh7肝細(xì)胞中miR-122-3p表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，同時(shí)miR-122-3p與HBV的復(fù)制相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-3p可與HBV RNA非編碼區(qū)的59號(hào)位點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)病毒的復(fù)制[9]。miR-122-3p還可以增加HBV的穩(wěn)定性，在一定程度上促進(jìn)疾病的進(jìn)展。羅丹等[10]通過(guò)對(duì)HBV患者的疾病進(jìn)展進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者的疾病進(jìn)展與miR-122-3p呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致。

miR-125b-5p可通過(guò)抑制肝細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制能力來(lái)降低病毒的感染作用[11]，而隨著患者肝細(xì)胞的損傷，細(xì)胞內(nèi)的miR-125b-5p釋放到血清中，呈現(xiàn)隨疾病進(jìn)展逐漸上升的趨勢(shì)。有學(xué)者在對(duì)HBV感染患者的疾病進(jìn)展研究中發(fā)現(xiàn)，隨著肝硬化程度惡化，細(xì)胞內(nèi)的miR-125b-5p水平顯著下降，外周血中的miR-125b-5p呈上升趨勢(shì)[12]，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)也有研究指出，miR-125b-5p還可抑制機(jī)體的wnt信號(hào)通路，進(jìn)一步降低局部病灶部位的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上降低HBV疾病的進(jìn)展[8,13-14]。在對(duì)患者的肝功能以及免疫功能的分析中，患者的miR-125b-5p、miR-122-3p與機(jī)體的肝功能以及免疫功能相關(guān)，驗(yàn)證了miR-125b-5p、miR-122-3p對(duì)于機(jī)體的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的預(yù)測(cè)。

此外，本文分析了患者的miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的效能，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的特異度優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)ROC曲線下面積顯著高于單獨(dú)檢測(cè)，且獲得miR-125b-5p、miR-122-3p最佳臨界值，可在一定程度上對(duì)治療效果進(jìn)行分析，及早對(duì)治療效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

綜上所述，miR-125b-5p、miR-122-3p的表達(dá)水平與HBV患者肝功能、免疫功能顯著相關(guān)，miR-125b-5p、miR-122-3p對(duì)HBV的治療效果具有預(yù)測(cè)價(jià)值。但是本研究還存在一定的局限性，由于納入的樣本量較小，還需在后期臨床研究中進(jìn)行驗(yàn)證。