郭 恒 葉廣繼 納添倉 王 艦 周 云 *

（1青海省農林科學院，青海西寧 810016；2青藏高原生物技術教育部重點實驗室，青海西寧 810016）

顏色的變化通常為判斷果實成熟的標準，綠色植物衰老和果實成熟的顯著標志是葉綠素降解和葉綠體轉化為色質體。然而，有些植株在生長末期還保持原有的綠色，未出現(xiàn)黃化或者出現(xiàn)很少的黃化現(xiàn)象，這是由于葉綠素降解很少。這種葉片或果實在成熟期仍然保持綠色的現(xiàn)象稱之為“滯綠”[1]。滯綠蛋白（stay-green proteins，SGR）作為核基因編碼葉綠體的靶蛋白，結構高度保守，其表達在葉綠素降解和器官衰老方面至關重要[2]。到目前為止，很多研究人員已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了滯綠突變體，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[3]、水稻（Oryza sativa）[4]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[5]、草甸羊茅（Festuca pratensis）[6]、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）[7-8]、辣椒（Capsicum annuum）[9]、 煙 草 （Nicotiana tabacum）、 香 蕉 （Musa AAA group）[10-11]、大豆（Glycine max）[12]等。Thomas等[13]通過葉綠素含量和光合速率的變化，將滯綠突變分為5種類型。延遲葉片衰老時間的A型，如玉米突變體fs855[13]；減緩葉綠素降解速率的B型，如高粱突變體R16[14]；抑制葉綠素降解的C型，如番茄gf突變體；受到自然或非自然影響后植物組織遭到破壞而葉綠素不發(fā)生降解的D型，如風干的標本及有病蟲害的農作物；植物雖然衰老但是葉綠素還能保持很長時間的E型。以上5種類型可以分為兩類，A型和B型屬于功能型滯綠突變，它們在衰老時期葉綠素未發(fā)生降解，葉片保持綠色，能進行較長時間的光合作用，因而被認為有可能提高作物產(chǎn)量；C型、D型和E型屬于非功能型滯綠突變，它們在維持滯綠性狀的同時，光合能力的下降速率和野生型相同，只是葉綠素降解受到影響。除了D型是由于外界刺激造成的以外，其他4種都有可能與其內源性基因調控有關。

在水稻滯綠突變體中分離出NYC1和NYC1-LIKE蛋白后[15-16]，在其他突變體中分離出了葉綠素降解的相關基因[16-20]。葉綠素降解途徑被阻斷或者抑制，使得葉綠素降解途徑不能繼續(xù)而發(fā)生滯綠。此外，部分茄科植物已經(jīng)成功克隆分離了SGR基因，并且在實踐生產(chǎn)中應用良好，但是在馬鈴薯中對于SGR的研究還較少。本文主要梳理和總結近年來SGR基因的研究進展，探討SGR在馬鈴薯上的應用前景和未來發(fā)展。

1 植物滯綠突變

植物的成熟、衰老是自然界中的普遍規(guī)律，葉綠素是植物光合作用的重要工具，其降解受到抑制后，葉片、種子等器官會出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象。孟德爾經(jīng)典實驗中把控制豌豆子葉顏色（黃色/綠色）的位點命名為I，該位點突變后不僅在種子成熟過程中子葉保持綠色，在衰老過程中葉片也保持綠色。1962年，Steinbuch等提出，蠶豆的持綠性對其成熟的程度和多樣性有作用，進而影響蠶豆最終產(chǎn)量、等級和品質。隨著對滯綠性狀的研究，滯綠性也成為評價玉米產(chǎn)量優(yōu)勢的重要指標和商業(yè)營銷手段。Robson等[21]將玉米衰老增強啟動子和IPT基因（IPT基因編碼細胞分裂素合成的一個限速酶）轉入玉米中，發(fā)現(xiàn)轉基因植株在衰老期合成大量細胞分裂素而表現(xiàn)出常綠性狀。同時，將來源于擬南芥的衰老特異啟動子SAG12和IPT基因連接，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草也能觀察到滯綠現(xiàn)象[22]。通過RNA干擾技術將擬南芥SGR基因沉默后，擬南芥植株會出現(xiàn)不同程度的滯綠現(xiàn)象。此外，在水稻、高粱等多種植物中均發(fā)現(xiàn)了葉片滯綠突變體[6]，在番茄、大豆等植物中也同時發(fā)現(xiàn)了果實和種子表現(xiàn)滯綠性狀的突變體。這些突變體在葉片衰老期或果實、種子成熟過程中仍然保留著較多的葉綠素，使器官呈現(xiàn)出區(qū)別于野生型的顏色。

目前，對于植物滯綠的研究主要圍繞著葉綠素新陳代謝路徑和其相關基因對于植物滯綠性的影響、葉片發(fā)育過程中光合作用和氮元素轉運對于葉片滯綠性的影響以及逆境條件對于植物滯綠性狀的影響等。影響植物滯綠性的因素很多，其中外因主要包括光周期現(xiàn)象、各種環(huán)境脅迫等，內因主要包括生理上滯綠現(xiàn)象和葉綠素的合成降解、離子轉運、植物激素調控、轉錄因子及microRNA調控等。滯綠突變體的形成原因是多方面的，外界特定環(huán)境的影響是一個不可忽視的因素，但表型不能遺傳，所以對植物本身可遺傳因素的研究更加重要。一方面，葉綠素降解代謝過程是由多個酶促反應完成的，代謝途徑中任何一種酶的活性受到抑制或相關基因發(fā)生變異，都會引起葉綠素降解受阻而出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象。例如，在草甸羊茅滯綠突變體中，脫鎂葉綠素a加氧酶PAO的活性顯著低于野生型，被認為是其表現(xiàn)滯綠性狀的主要原因。另外，PAO酶活性減弱也已被證明是多數(shù)C型突變體（如豌豆、菜豆等）滯綠的關鍵因素。除PAO以外，葉綠素b還原酶、羥甲基葉綠素a還原酶活性降低或缺失也會導致葉綠素降解受阻引起滯綠[23-24]。另一方面，Efrati等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)辣椒cl滯綠突變體和番茄gf滯綠突變體，2個同源基因突變可能是二者滯綠表型形成的原因；進一步分析認為，突變基因并非葉綠素降解代謝途徑中關鍵酶的結構基因，而可能是調控基因。Kerr通過對番茄滯綠突變體gf遺傳連鎖關系進行分析發(fā)現(xiàn)，滯綠性狀是由單一隱性核基因控制，該基因被定位于番茄的第8號染色體上。通過分析大豆的雜交后代，確定了大豆種子滯綠的4個突變位點D1、D2、G和cytG，其中：隱性遺傳基因D1和D2雙基因突變會導致種子滯綠；D1和G連鎖突變則會引起種皮滯綠；cytG是細胞質遺傳基因位點，該基因位點突變會使大豆衰老葉片的葉綠素含量穩(wěn)定，不易轉化為葉綠素a，阻礙葉綠素降解代謝的發(fā)生。

2 植物滯綠相關基因

SGR基因是葉綠素降解調控研究中的一個里程碑，在葉綠素降解的最初階段表達，調節(jié)與衰老相關的色素降解。葉綠素降解早期反應過程主要是在由NYC/NOL和HCAR基因的產(chǎn)物催化下葉綠素b通過兩步酶還原反應轉化為葉綠素a，這些基因的突變會造成出現(xiàn)修飾性的滯綠。然而，在擬南芥中SGR、NYC1、PPH和ACD2等基因都是通過轉錄水平調控基因的表達?？傊?，SGR基因可通過調控葉綠素降解與合成相關基因在葉綠素合成和降解代謝途徑中的表達，從而控制葉片滯綠表型。

目前，已在多種植物中鑒定得到NYE1的直系同源基因，如NYC1、CRN1、NYC3等基因在植物體內高度保守，當植物成熟和衰老時這些基因發(fā)生表達導致葉片或果實滯綠的表型特征，研究者們將這些基因統(tǒng)稱為衰老誘導的葉綠體滯綠相關蛋白基因。自擬南芥基因組測序完成之后，人們通過快中子誘變突變體篩選得到一個滯綠突變體nye1-1，并通過圖位克隆獲得了一個葉綠素降解代謝的關鍵調控基因NYE1。從2006到2007年，至少5個獨立的研究小組在不同物種中成功鑒定到NYE1的直系同源基因。通過基因滲入法，將bf993的y基因位點轉移到黑麥草屬物種中[26]，利用圖位克隆技術，y基因位點首先被粗定到5號染色體中一個10 cM遺傳距離區(qū)域。通過對TIGR數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，該遺傳區(qū)域包含30個基因，其中一個基因Os09g36200和擬南芥衰老相關基因At4g22920高度同源。分析2個不同的水稻sgr突變體和擬南芥nye1-1突變體后發(fā)現(xiàn)，造成這些突變體滯綠表型的是同一個基因。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，有更多滯綠突變體的遺傳缺失都是由這個滯綠基因（NYE1/SGR）失活造成的。

滯綠基因主要來源于非功能滯綠突變體，作為葉綠素分解的啟動因素，主要調控PsⅡ捕光-葉綠素（LHCⅡ-Chl）復合體的拆卸。滯綠基因如果缺失會造成在衰老過程中葉綠素降解受到抑制，但是葉綠體類囊體膜和葉綠素蛋白復合體結構保持完整，光合能力也隨之下降。目前，關于SGR基因調控葉綠素降解的作用機制研究仍處于起步階段。對于衰老葉片和成熟種子或果實中葉綠素的降解，有研究認為，SGR1/NYE1可以與光捕獲復合物Ⅱ （LHCⅡ）結合，制約了sgr突變體中葉綠素和LHC蛋白的降解。此外，SGR1/NYE1蛋白也可與葉綠素降解關鍵酶CCEs形成互作關系。對于種子成熟過程中的葉綠素降解，最新研究發(fā)現(xiàn)，ABI3通過與SGR1/NYE1和SGR2/NYE2的啟動子結合正向調控基因表達，從而促進種子成熟過程中葉綠素的降解[27-28]。

SGR基因家族中的突變已經(jīng)被指定為C型滯綠突變體，其缺乏葉綠素分解能力，但具有其他正常的衰老模式。C型滯綠突變體的一個特征是光捕獲葉綠素結合蛋白（LHCP）在葉和果實中持續(xù)，而其他衰老過程如正常一樣繼續(xù)，這表明色素蛋白復合物的去穩(wěn)定化是葉綠素降解所必需的。水稻SGR已被證明在體內和體外結合LHCPⅡ蛋白，這表明它可能會使色素-蛋白相互作用不穩(wěn)定，因而允許蛋白酶和分解代謝酶的作用分別降解LHCP和葉綠素。在SGR中，單個氨基酸取代的可用性將有助于更詳細地研究該蛋白的結構功能。導致強表型效應的4個氨基酸的取代現(xiàn)已在水稻、番茄和辣椒中的SGR直系同源物中鑒定。這些取代中，3個發(fā)生在跨物種邊界的所有SGR家族成員內不變的氨基酸殘基中，第4個SGR V99M發(fā)生在以大約相等的頻率表征Val或Ile的殘基處。水稻SGR中的V99M替代不破壞與LHCPⅡ的結合，表明該氨基酸對于SGR功能的一些其他方面可能是重要的，例如未知的催化活性或三級結構[29]。在水稻和擬南芥中，SGR的過表達產(chǎn)生了具有蒼白表型的葉或組織培養(yǎng)轉移后死亡的植物。擬南芥NYE1（At4g22920）的低水平過表達導致正常植物表型，而高水平表達導致葉片黃化，表明NYE1/SGR表達水平與葉綠素損失之間存在直接相關性。SGR基因在其他高等綠色植物中也相繼被克隆出來，研究表明：SGR基因由核基因編碼，翻譯261～269個氨基酸；SGR蛋白都包含一個高度保守的C末端結構域（C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P），這段保守結構域被從SGR蛋白高度保守的核心區(qū)分隔開，位于相似性較低的區(qū)域[30]；在N-端通常含有一個葉綠體的信號肽，其常在衰老誘導條件下完成特異表達，但它們如何發(fā)揮功能調控葉綠素的降解，目前還不清楚。

3 SGR的功能

歷史上，SGR的缺陷與減少的PAO活性或表達相關。被歸因于SGR的許多滯綠突變體表現(xiàn)出低水平的PAO活性，而其他分解代謝酶（特別是葉綠素酶和RCCR）的活性不受影響。PAO最近的分子克隆和PAO抗體的可用性允許詳細分析滯綠突變體中PAO表達和蛋白質豐度。PAO活性的差異與用于測定的提取物中的PAO豐度相關，表明突變體和野生型之間的差異是僅由PAO的不均等效提取引起的假象。

SGR突變體的共同特征是在衰老過程中保留光合器官的葉綠素結合蛋白。特別地，LHCⅡ亞基在迄今為止分析的所有SGR缺陷型突變體中高度穩(wěn)定。歷史上，這已經(jīng)通過與同時保留的葉綠素的連接來解釋，即認為有缺陷的葉綠素降解在SGR突變體中被認為是葉綠素結合蛋白降解的前提條件。bf993顯示累積了一個沒有其N末端基質區(qū)域的LHCⅡ亞基的特定蛋白水解片段。這進一步指出了對LHC蛋白完全降解的葉綠素降解要求。

但是，這種觀點可能是錯誤的。如上所述，迄今分析的PAO和所有其他分解代謝酶在SGR突變體中不受影響。SGR蛋白的鑒定并不表示可能的功能，因為SGR不包含任何已知的結構域。此外，葉綠素分解代謝步驟的酶活性，如葉綠素酶去飽和[30-31]不能歸因于SGRs。從葉綠素蛋白復合物中提取葉綠素并與載體蛋白結合被認為是適當?shù)娜~綠素和（可能）脫蛋白降解的要求。然而，與已知的葉綠素結合蛋白相比，水溶性葉綠素結合蛋白、SGR在體外不能結合葉綠素。因此，假設SGR根本不是酶，這是合理的。最近的共免疫沉淀試驗表明，OsSGR能夠在體內特異性結合LHCⅡ亞基，但不與LHCⅠ亞基或葉綠素結合的核心復合物亞基（如D1）相互作用。這種結合也發(fā)生在OsSGR的V99M突變中，表明突變不影響結合。有人提出突變可能影響（未知）酶活性或可能破壞其他調節(jié)因子的結合，需要對其他SGR點突變進行功能分析來證實這一點。

總之，SGRs可能是參與LHCⅡ拆解的蛋白質因子的候選者，SGR在衰老過程中不間斷地使葉綠素保持在穩(wěn)定的脫輔基蛋白內。在這方面，SGR表達將是葉綠素分解的先決條件，但不是分解代謝因子本身。在NYC1和NOL突變體中，還保留了葉綠素和葉綠素結合蛋白。因此，似乎可能的是，2個因子同樣重要，以誘導葉綠素蛋白復合物的不穩(wěn)定性。此外，在PAO突變體衰老過程中，AtSGR1的mRNA水平降低，表明存在反饋機制。這種調節(jié)機制可以被看作是安全控制，以確保葉綠素降解僅在葉綠素分解代謝過程中才會發(fā)生。因此，除了分解代謝酶活性或表達的調節(jié)之外，通過SGR調節(jié)載脂蛋白拆解可以被認為是啟動葉綠素分解所需的主開關。

4 茄科植物滯綠機理及其作用

人們長期研究的茄科植物有馬鈴薯、辣椒、番茄、煙草等。其中，煙草和番茄作為茄科植物的模式植物被深入研究。番茄和辣椒的綠色果肉（gf）和葉綠素保留（cl）的突變分別是在成熟期間抑制其降解葉綠素的能力，葉綠素和類胡蘿卜素累積導致產(chǎn)生成熟果實，在顏色上變?yōu)樽厣?。gf和cl的表達在果實成熟開始時被高度誘導，與葉綠素的下降相關。由于番茄紅素的積累和缺乏葉綠素降解，果實和葉片變?yōu)樽厣由先~綠素的保留，類囊體顆粒、LHCP、Rubisco小亞基和33 kD氧化轉化蛋白質也在突變果實和葉片中繼續(xù)存在（圖1）。因此，gf被分類為番茄的C型滯綠突變體。隨著對gf和cl基因的不斷研究，已在水稻中發(fā)現(xiàn)gf基因的點突變，導致水稻的SGR番茄同系物中一個不變殘基的氨基酸被取代。同樣也發(fā)現(xiàn)，cl的突變也在SGR的辣椒同系物中有不變殘基的氨基酸的取代。同時，在草甸羊茅、豌豆、水稻和擬南芥中也鑒定出C型突變體降低了葉綠體中的PAO活性和色素蛋白復合物的穩(wěn)定性[31]。最新研究得出，這些基因可能編碼新的葉綠體靶向蛋白，促進葉綠素在類囊體膜中色素蛋白復合物的不穩(wěn)定性降解。gf和cl突變基因的分子基礎研究為番茄和辣椒的商業(yè)育種提供了早期選擇性狀的重要依據(jù)。

5 展望

馬鈴薯是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物，全球種植面積約為1 870萬～1 920萬hm2，總產(chǎn)量為3.2億～3.4億t[32]。我國馬鈴薯種植面積與產(chǎn)量均居世界第一，且產(chǎn)量達到世界的20%左右[33]，提高單產(chǎn)是我國馬鈴薯育種的主要目標。馬鈴薯在育種過程中主要采用常規(guī)育種，而育種過程中主要是以抗病、抗旱為基礎。在滯綠突變延長光合作用時間方面的深入研究為人們在馬鈴薯增產(chǎn)育種方面提供了新的思路和方向。由于不同作物存在相同的滯綠表型，但是基因型卻不同，如同一滯綠性狀可能受不同基因控制，同一基因功能缺損的程度不同也可能會造成不一樣的滯綠類型[34]。因此，研究不同類型滯綠基因并進行克隆及功能性驗證，明確其對于延緩作物衰老的作用及機理，降低葉綠素分解速率，延長光合作用時間，對提高作物產(chǎn)量有重要意義。

目前，育種學家通過雜交育種的標記研究發(fā)現(xiàn)，滯綠突變體在莖稈抗逆能力（抗病、抗干旱、抗倒伏等）方面具有很強的優(yōu)勢，可作為遺傳改良的育種材料[35-36]。參與葉綠素降解過程的滯綠基因SGR/SGRL可 以 同 多 種 CCEs（NYC1、NYE、PPH、PAO、HCAR、RCCR）和LCHⅡ發(fā)生互作，形成SGR-CCE-LHCⅡ大分子復合物，該大分子復合物可以降低葉綠素降解產(chǎn)物pFCC對細胞的毒害作用[28]。伴隨著現(xiàn)代分子育種學的深入研究發(fā)現(xiàn)，SGR/SGRL基因普遍存在于高等植物中。但是，SGR/SGRL基因啟動子順式作用元件及其調控活性的研究報道還很少，與SGR/SGRL基因互作的關鍵轉錄因子能否引起植物滯綠表型等諸多問題尚待解開。

目前，對于青海省主導品種青薯9號的深入研究發(fā)現(xiàn)，該品種生育期較長，在生長后期一直保持綠色狀態(tài)。因此，筆者以該品種為研究對象，克隆該品種的SGR基因，發(fā)現(xiàn)該基因的開放閱讀框819 bp，編碼272個氨基酸。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，其包含了SGR的典型結構域；系統(tǒng)進化樹分析顯示，其與擬南芥、番茄和辣椒等SGR基因具有較高的同源性。對馬鈴薯SGR基因功能進行深入研究，可為其在馬鈴薯生產(chǎn)實踐中提供更廣闊的應用前景。