王燦良，任顯鋒，陳傳剛，韋良震，王飛翔，王雪鵬

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.泰安市水產(chǎn)研究所，山東 泰安 271411；3.曲阜漁豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東 曲阜 273100；4.濟寧南陽湖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東 濟寧 272100)

錦鯉(Cyprinus carpio)在動物分類系統(tǒng)上屬于鯉科(Cyprinidae)，在我國屬于知名度較高的觀賞魚種類，有“水中活寶石”“會游泳的藝術(shù)品”等美譽，具有較高的經(jīng)濟價值(許品章，2004)。近年來，隨著人們對觀賞魚需求量逐漸增大，錦鯉養(yǎng)殖集約化程度越來越高，隨之而來的錦鯉病害給錦鯉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了阻礙(宋東鎣等，2015)。

為探明造成2021年山東省濟寧市某錦鯉養(yǎng)殖場錦鯉暴發(fā)性死亡的致病菌，本研究對采集的錦鯉發(fā)病樣本進行了細菌分離、質(zhì)譜分析和分子鑒定、回歸感染、藥物敏感性等，為錦鯉養(yǎng)殖中病害防控提供了科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料

發(fā)病錦鯉和用于回歸感染試驗的健康錦鯉均來自濟寧某錦鯉養(yǎng)殖場。發(fā)病錦鯉體表有鱗片脫落、出血斑等病變現(xiàn)象，鰓部顏色淡紅。

2.菌株分離、純化與病理切片制備

無菌操作法在病魚肝胰臟、脾、腎臟取菌，劃線于LB瓊脂培養(yǎng)基上，30℃溫箱培養(yǎng)24小時，再次劃線LB瓊脂培養(yǎng)基兩次得到純培養(yǎng)菌株，保存?zhèn)溆?。取瀕死發(fā)病魚內(nèi)臟團，按常規(guī)方法制作石蠟切片：4%甲醛溶液4℃固定3天，經(jīng)過各級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，每尾魚各制備10張，蘇木素－伊紅染色，貼片，固封(王雪鵬等，2011)。用顯微鏡觀察，并完成圖像捕獲和處理。

3.分子鑒定

利用本實驗室保存的細菌16S r DNA通用引物(上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為95℃5分鐘；95℃30秒、52℃40秒、72℃1分鐘，30個循環(huán)；72℃5分鐘。所得產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

4.質(zhì)譜分析

取上述分離、純化的優(yōu)勢菌標記好，涂布于色譜柱上，而后滴加2微升甲酸、2微升基質(zhì)溶液，在超凈臺內(nèi)自然風干后，掃描色譜柱條碼錄入信息后打開軟件進行質(zhì)譜測定(Sascha S等，2017)。

5.菌液濃度測定

為方便計算菌液細菌含量以及確定回歸實驗接種細菌數(shù)量，計算半數(shù)致死量等。取吸光度OD(600納米)值為2.0時的菌液，10倍比吸收稀釋，設(shè)計了兩組平行平板組A1、A2、A3、B1、B2、B3，分別取稀釋了107、108、109倍的菌，100微升涂平板A1、A2、A3、B1、B2、B3；經(jīng)20小時、30℃恒溫培養(yǎng)后，取出計算單菌落，平板涂菌計數(shù)，確定吸光度與細菌數(shù)的關(guān)系。

6.藥敏試驗

利用紙片擴散法進行本次藥敏試驗。將上述稀釋OD(600納米)值為2.0的菌液100微升涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上，貼上藥敏紙片，共14種藥物，30℃倒置培養(yǎng)20小時后測量抑菌圈直徑。

7.致病性與回歸感染試驗

為探究該分離菌的致病性，筆者準備了一批體質(zhì)健康、體重在50～200克的錦鯉，事先在控溫水循環(huán)水箱中靜養(yǎng)5天，靜養(yǎng)期間保持溫度28℃左右且不喂飼料。5天后，挑選30尾體重在(100±10)克的錦鯉進行本次試驗，試驗設(shè)5個試驗組與1個對照組，每組各5尾。采用上述原液(標記為W0)、稀釋10倍(標記為W1)、100倍(標記為W2)、1000倍(標記為W3)、10000倍(標記為W4)和PBS溶液(陰性對照，標記為W5)進行腹腔注射感染。每尾健康錦鯉注射0.1毫升。水溫為28℃左右，正常飼養(yǎng)。每天觀察、記錄魚的發(fā)病癥狀、死亡數(shù)量等，連續(xù)觀察1周。對上述人工回歸感染出現(xiàn)明顯癥狀的病魚再次進行菌株分離后進行質(zhì)譜分析和分子鑒定，并取瀕死錦鯉肝臟、脾臟、腎臟做病理觀察。

二、結(jié)果

1.細菌分離、純化

發(fā)病魚肝胰臟、脾臟、腎臟充血發(fā)紅、出血(圖1)。從內(nèi)臟各器官所分菌株菌落特征較為一致，得到一株菌落呈乳白色、圓點狀、邊緣平滑的優(yōu)勢菌(圖2)，該菌革蘭氏染色為陰性(圖3)。病理組織學(xué)檢查以肝臟水腫變性，肝細胞萎縮、壞死，脾臟和腎臟充血、水腫等病變?yōu)橹?圖4～圖6)。

圖1 病死魚剖檢

圖2 菌株分離純化

圖3 純化菌株革蘭氏染色

圖4 剖檢魚肝臟切片

圖5 剖檢魚脾臟切片

圖6 剖檢魚腎臟切片

2.細菌鑒定

所擴增的PCR產(chǎn)物長度約為1500bp(圖7)，對瓊脂糖電泳為1500bp的條帶進行測序，得到16SrDNA序列。該序列經(jīng)BLAST對比，結(jié)果與維氏氣單胞菌序列相似性達99.93%以上，與其他維氏氣單胞菌的距離比例(系統(tǒng)發(fā)育樹)見圖8。質(zhì)譜分析結(jié)果進一步證實，該菌為維氏氣單胞菌，命名為Aeromonasveronii-1。

圖7 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖8 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3.藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，四環(huán)素類、頭孢類、β-內(nèi)酰胺類抗生素在本次藥敏試驗中展現(xiàn)了極好的抗菌效果，磺胺類、氨基糖苷類抗革蘭氏陰性菌抗生素亦有較好的療效，而抗革蘭氏陽性菌的青霉素類則基本沒效果，詳見表1。

表1 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

4.OD值為2.0時菌液濃度測定、LD50測定及回歸感染

當OD(600納米)值為2.0時，測定該分離株維氏氣單胞菌的濃度為1.159×1011CFU/毫升。人工感染健康錦鯉后，不同接種濃度呈現(xiàn)不同的死亡情況，W0、W1、W2、W3、W4、W5組死亡數(shù)分別為4、5、3、2、1、0尾。根據(jù)Reed-Muench法計算，該菌株的LD50測定為5.383×107CFU/尾。人工回歸感染病死魚只在內(nèi)臟中再次分離鑒定出了維氏氣單胞菌。

三、討論

近年來，細菌、病毒類疾病給錦鯉養(yǎng)殖業(yè)帶來較大沖擊，其中嗜水氣單胞菌、黃桿菌、錦鯉皰疹病毒、車輪蟲、小瓜蟲等較為常見。目前，細菌鑒定的最經(jīng)典方法是生化鑒定，但存在工作量大、耗時長、敏感度低等缺點。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，16SrRNA基因檢測技術(shù)因其快速簡便、特異性較高等優(yōu)點，被廣泛用于細菌的種屬鑒定，但也存在對親緣關(guān)系較近的細菌鑒別率不高等缺點。近年來，隨著質(zhì)譜檢測技術(shù)(MALDI-TOFMS)的不斷完善和發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于微生物的鑒定。MALDI-TOFMS大大縮短了細菌鑒定的時間，而且成本也較常規(guī)鑒定方法低，被廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)合分子遺傳學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)，兩者相互輔證、互為補充，使鑒定結(jié)果更為準確可靠。

本試驗結(jié)果與楊求華等(2012)、高金偉等(2016)的結(jié)果不一致。但是，本試驗所用的國標藥物氟苯尼考和恩諾沙星具有良好的抗菌效果，可在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。