武菊平，霍 捷，杜佳燕，耿麗平，李博文，陳苗苗，劉文菊

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室/河北省綠色高效蔬菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；2. 保定市農(nóng)業(yè)科學院，河北 保定 071000)

辣椒(Capsicum annuumL.)是茄科類重要的蔬菜作物，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)［1］。辣椒單一連作種植，易造成連作障礙，降低其產(chǎn)量及品質(zhì)［2］，引起土壤酸化、土壤微生物區(qū)系失調(diào)［3-4］。江西省設施辣椒連作10 年以上，其中83%辣椒連作的大棚土傳病害發(fā)病率在36%以上，產(chǎn)量下降30%［5］。在河北省，辣椒連作導致植株生長緩慢、產(chǎn)量下降，葉片保護酶活性降低，土壤由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)化［6］。因此，許多研究者在尋求合適的修復劑，來緩解辣椒連作造成的土壤障礙。

生物炭和枯草芽孢桿菌作為修復劑，一方面生物炭具有多孔結(jié)構，有較強的吸附性能［7］，可以增加生物炭對菌的吸附量，為枯草芽孢桿菌提供生存空間［8］，另一方面一次性將二者復配后的產(chǎn)品施入土壤可省時省力。有研究表明，單獨施用枯草芽孢桿菌可促進番茄植株生長，顯著提高細菌和真菌的比值，降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量，從而緩解番茄連作障礙［9］；枯草芽孢桿菌也可抑制導致辣椒連作障礙的病原菌—立枯絲核菌的生長［10］，但是緩解番茄和辣椒連作障礙均表現(xiàn)在枯草芽孢桿菌定殖15 d 之后。同時，單施生物炭可通過提高產(chǎn)量、促進土壤向細菌型土壤轉(zhuǎn)化，在一定程度上可以緩解黃瓜連作障礙［9］，然而單施生物炭對連作辣椒并沒有明顯的促生作用，對辣椒疫病也沒有明顯的抑制作用［11］。此外由于生物炭呈堿性，而枯草芽孢桿菌的適宜的介質(zhì)pH 在7.0～7.5 之間，木醋液是生物炭的副產(chǎn)品［12］，其酸度較高，可以用來調(diào)節(jié)生物炭pH 至中性，那么負載枯草芽孢桿菌的生物炭或者木醋液改性生物炭，施入辣椒連作土壤中是否可促進辣椒生長和調(diào)控土壤微生物區(qū)系，從而緩解土壤的連作障礙有待進一步探究。

基于此，本研究以辣椒連作10 年的土壤為主要研究對象，采用土壤盆栽試驗探索生物炭負載枯草芽孢桿菌是否有效緩解辣椒連作對土壤造成的生產(chǎn)障礙，明確生物炭和枯草芽孢桿菌對辣椒連作土壤障礙的修復效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用土壤采于河北省邯鄲市雞澤縣魏青村國家特色農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)勢區(qū)椒連作10 年的種植基地。土壤基本理化性質(zhì)為：pH 7.35，可溶性鹽濃度EC 值0.16 mS/cm，有機質(zhì)17.05 g/kg，硝態(tài)氮15.77 mg/kg，銨態(tài)氮6.04 mg/kg，速效磷50.30 mg/kg，速效鉀285.48 mg/kg［13］。試驗用辣椒品種‘羊角紅一號’為雞澤縣主栽辣椒品種。試驗用生物炭和木醋液是由河北承德華凈活性炭有限公司提供。生物炭的基本理化性質(zhì)為：pH 9.62，全碳 54.81%，全氮 0.75%，速效磷 348 mg/kg，速效鉀 6.97 g/kg；木醋液的pH 為4.70。試驗用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus SubtilisS16）由本實驗室前期篩選保存。試驗用培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年9 月在河北農(nóng)業(yè)大學土壤微生物實驗室開展。

（1）枯草芽孢桿菌S16 的菌懸液制備：用接種環(huán)取一環(huán)由本實驗室保存的枯草芽孢桿菌S16 接種在倒有LB 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在恒溫箱中30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，對枯草芽孢桿菌S16 進行活化；取已經(jīng)活化好的枯草芽孢桿菌S16 菌株放入LB 培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，得到種子液，按1%的接種量接入LB 培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)48 h，得到枯草芽孢桿菌S16 的菌懸液。

（2）負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭材料制備：將制備好的枯草芽孢桿菌S16 的菌懸液，按生物炭和菌液質(zhì)量體積比為1∶5 混合后在30 ℃，130 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，使枯草芽孢桿菌S16 附著在生物炭上，過濾并風干后得到負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭材料。

（3）負載枯草芽孢桿菌S16 的木醋液改性生物炭材料制備：將木醋液和生物炭按體積質(zhì)量比1∶3混合后，自然風干后測得生物炭pH 為7.2，將木醋液改性生物炭與上述菌液按質(zhì)量體積比1∶5 混合后在30 ℃，130 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，使菌液中的枯草芽孢桿菌S16 附著在生物炭上，用濾紙過濾并風干得到負載枯草芽孢桿菌S16 的木醋液改性生物炭材料［13］。

1.3 試驗設計

土壤盆栽試驗于2020 年10 月在河北農(nóng)業(yè)大學人工氣候室開展土壤培養(yǎng)試驗。試驗設置如下4 個處理：對照（CK）、生物炭(B)、負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭（BC）、負載枯草芽孢桿菌S16 的木醋液改性生物炭（BHC），生物炭添加量為土重的2%，每個處理4 個重復，分別在辣椒幼苗期、開花期、成熟期進行破壞性取樣，每次取4 盆，共48 盆，隨機排列。

將土壤風干后過篩，按處理將生物炭、負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭或木醋液改性生物炭以及底肥與土壤分別充分混勻，分裝到每個培養(yǎng)缽（110 mm×150 mm），每盆1.30 kg 連作土，其中底肥以N：200 mg/kg，P2O5：150 mg/kg，K2O：200 mg/kg 計算，以尿素、磷酸二銨和硫酸鉀的形式施入。之后置于人工氣候室中，使土壤保持田間持水量70%～80%。種子先后經(jīng)75%乙醇和1%次氯酸鈉消毒后，采用無菌水沖洗數(shù)次后，分裝在鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿（?9 mm）中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至露白，將露白的種子播種到土壤中［6］。

1.4 樣品的采集與測定

（1）植物樣品：記錄辣椒開花的時間、花朵數(shù)、結(jié)果時間；在辣椒不同生育期取樣，用剪刀將地上部和根系分開，用自來水將地上部和根系沖洗干凈，用吸水紙將根系和地上部所有水分擦干，放在烘箱中85 ℃殺青15 min，65 ℃烘干至恒重，稱量并記錄地上部和根系的鮮、干重［6］。

（2）土壤樣品：將根系表面松散土壤抖落，將根系放入自封袋中，放入超聲清洗器中4 ℃超聲20 min，收集袋內(nèi)土壤得到根際土［13］，放入4 ℃冰箱保存，測定土壤微生物數(shù)量，采用稀釋涂布平板法，細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、真菌用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基、放線菌用改良高氏一號培養(yǎng)基［14］；收集盆內(nèi)剩余土壤為非根際土，取部分鮮土放入4 ℃保存，用于測定非根際土壤微生物數(shù)量，取部分鮮土放入-20 ℃保存，用于測定土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，將剩余土壤自然風干，過1 mm 篩測定土壤pH 值和土壤有機質(zhì)和速效磷。其中土壤pH 采用土水比1∶2.5 浸提用pH 計測定；有效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗分光光度法測定；有機質(zhì)使用重鉻酸鉀外加熱法測定；土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮用KCl 浸提—流動分析儀測定［15］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SPSS 25.0 軟件進行方差分析，LSD 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對辣椒生長的影響

辣椒的開花和結(jié)果時間以及花朵數(shù)如表1所示。其中，與CK 相比，B、BC、BHC 3 個處理均促進辣椒植株的開花和結(jié)果，顯著增加辣椒植株花朵數(shù)，分別增加2.33、4.14 和2.14 倍；BC 和BHC 處理分別與B 處理相比，均可以促進辣椒提前開花和結(jié)果1～2 d，其中BC 處理可使辣椒植株的花朵數(shù)顯著增加54.24%。說明生物炭、負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭或木醋液改性生物炭均可促進連作土壤中辣椒的開花和結(jié)果時間提前，同時也顯著提高辣椒植株的花朵數(shù)。

表1 施用負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對辣椒開花和結(jié)果的影響Table 1 Effects of biochar loaded with Bacillus subtilis S16 on flowering and fruiting of chili pepper

不同生育期辣椒的生長如表2 所示，在幼苗期，與CK 相比，只有BHC 處理的地上部干重、地下部鮮重、地下部干重分別顯著降低54.93%、47.33%、40.00%，其他指標差異不顯著。與B 處理相比，BC 處理的根冠比顯著增加34.78%，BHC 處理的地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重顯著降低50.69%、57.33%，45.89%，其他指標差異不顯著。與BC 處理相比，BHC 處理的地上部干重、地下部鮮重、地下部干重分別顯著降低51.52%、46.98%、40.00%，其他指標差異不顯著。

表2 施用負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對辣椒不同生育時期植株生長的影響Table 2 Effects of biochar loaded with Bacillus subtilis S16 on plant growth of chili pepper at different growth stages

在開花期，與CK 相比，無論是添加生物炭還是負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭（BC 和BHC）處理，辣椒地上部鮮重均分別顯著增加179.84%、152.16%、126.80%，地上部干重分別顯著增加90.27%、103.04%、61.40%，地下部鮮重分別顯著增加253.62%、244.20%、209.78%，地下部干重分別顯著增加155.32%、161.70%、125.53%，根冠比分別顯著增加29.41%、41.18%、41.18%。

在成熟期，與CK 相比，B 處理的地下部干重顯著降低30.81%，BHC 處理的地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重分別顯著降低39.92%、38.74%、27.05%。與B 處理相比，BHC 處理地上部鮮重和地上部干重分別顯著降低39.71%和35.19%。BHC 處理與BC 處理相比，地上部鮮重和地上部干重分別顯著降低30.13%和26.37%。

由以上可知，在辣椒3 個生育時期中，3 種連作障礙修復材料：生物炭處理（B）、負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭處理（BC）、負載枯草芽孢桿菌S16 的木醋液改性生物炭處理（BHC）分別與對照相比，開花期植株生物量均顯著提高。這說明辣椒連作造成的土壤障礙問題在開花期顯著抑制了新一茬辣椒的生長，而添加生物炭、負載枯草芽孢桿菌S16 的2 種生物炭后，顯著促進了花期辣椒植株的生長，也就是說3 種修復劑的施用緩解了辣椒連作的土壤障礙，其中，負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭促進辣椒植物生長的效果最好。

2.2 負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對連作土壤pH 和土壤養(yǎng)分含量的影響

從3 個關鍵生育期來看（圖1），負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭處理（BC 和BHC）與CK 相比，開花期土壤pH、有機質(zhì)、硝銨態(tài)氮和有效磷的含量變化最為顯著。其中3 個生育期內(nèi)的土壤pH 只有BHC 處理顯著低于CK，分別降低0.13、0.30、0.26，BC 處理僅在幼苗期顯著低于CK，降低了0.15，這說明從開花期后該處理的植株生長旺盛，緩解了土壤酸堿度的變化；從土壤有機質(zhì)含量來看，負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭在3 個關鍵生育期均顯著提升了土壤有機質(zhì)含量，增幅為80.84%～124.64%；土壤硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)出幼苗期＞開花期＞成熟期的趨勢，這間接說明開花期后辣椒開始旺盛生長，大量吸收土壤氮素導致土壤中硝態(tài)氮含量呈逐漸降低的趨勢。尤其值得關注的是，開花期土壤硝態(tài)氮BC 和BHC 處理顯著低于CK，降幅分別為93.16%和84.94%，這是因為這2 個處理顯著促進植株生長所致。與土壤硝態(tài)氮相比，銨態(tài)氮的變化不大；從土壤有效磷含量的變化來看，與對照相比，幼苗期、開花期和成熟期BC 處理的土壤有效磷含量均顯著增加，增幅分別為12.37%、12.30%、19.06%，同時幼苗期和開花期BHC 處理的土壤有效磷含量也顯著增加，增幅分別為9.24%和12.11%。這可能與枯草芽孢桿菌具有溶磷能力有關。

圖1 施用負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對連作土壤pH、有機質(zhì)和有效氮磷養(yǎng)分含量的影響Fig.1 Effects of biochar loaded with Bacillus subtilis S16 on pH, organic matter and available nitrogen and phosphorus contents of continuous cropping soil

2.3 負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對連作土壤微生物區(qū)系的影響

根際土壤微生物區(qū)系的測定如表3 所示，與CK、B 和BC 處理相比，根際土壤細菌的數(shù)量在3個關鍵生育期中，幼苗期的BHC 處理顯著降低，降幅分別為73.43%、70.43% 和66.87%，而在開花期和成熟期BHC 處理比B 處理分別顯著增加247.71%、56.98%，在成熟期BHC 處理比BC 處理顯著增加46.97%。

表3 施用負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭的連作根際土壤微生物數(shù)量Table 3 Effect of biochar loaded with Bacillus subtilis S16 on soil microbial quantity in continuous cropping rhizosphere soil

與CK 相比，根際土壤真菌的數(shù)量在幼苗期B和BC 處理分別顯著增加126.72%和110.34%，而在開花期卻分別顯著降低52.96%和46.08%，此外開花期的BHC 處理也顯著降低66.73%，而成熟期的BHC 處理顯著增加89.89%。

與CK 相比，根際土壤放線菌數(shù)量在開花期B、BC 和BHC 處理分別顯著增加159.68%、325.81%和191.94%；與B 處理相比，在成熟期BC 處理顯著增加63.98%，此外，在成熟期BHC 處理顯著降低29.00%；與BC 處理相比，在開花期BHC 處理顯著降低31.44%。

根際土壤B/F 只有幼苗期BC 處理顯著高于CK和B 處理，分別顯著增加266.14%和263.78%，其它處理差異不顯著。

非根際土壤微生物區(qū)系的測定如表4 所示，與CK 相比，非根際土壤細菌數(shù)量在幼苗期B 和BC處理分別顯著增加115.09%和90.57%；與B 處理相比，在開花期和成熟期BC 顯著降低34.00%和34.01%。

表4 施用負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭對連作非根際土壤微生物數(shù)量的影響Table 4 Effect of biochar loaded with Bacillus subtilis S16 on soil microbial quantity in continuous cropping non-rhizosphere soil

與CK 相比，非根際土壤真菌數(shù)量在幼苗期BHC 處理顯著增加2.5 倍，此外，在幼苗期BHC 處理比B、BC 處理分別顯著增加4.44 和3.45 倍，其他時期卻比BC 處理分別顯著降低57.30%和54.47%。

與CK 相比，非根際土壤放線菌數(shù)量在幼苗期B 處理顯著增加102.78%，開花期B、BC 和BHC處理分別顯著增加7.31、5.73 和3.85 倍，成熟期各處理差異不顯著。

與CK 相比，非根際土壤B/F 在3 個關鍵生育時期中，幼苗期的BC 處理顯著增加275.05%，開花期各處理差異不顯著，成熟期的BHC 處理顯著增加230.43%。

綜上所述，負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭在開花期對根際土壤微生物的影響最明顯，降低土壤真菌數(shù)量，增加土壤放線菌數(shù)量。其中，多數(shù)病原菌為真菌，減少其對植株的侵害，放線菌主要為土壤中病原菌的拮抗菌，增加土壤抗病能力，因此，對修復辣椒連作土壤的障礙問題起到積極作用。

3 討論

辣椒連作障礙一般表現(xiàn)為植株生長受抑制、產(chǎn)量降低、土壤養(yǎng)分不平衡和土壤微生物區(qū)系失調(diào)［5］，嚴重影響了辣椒產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。因此，修復辣椒連作障礙問題勢在必行。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，生物炭和枯草芽孢桿菌作為設施菜田土壤連作障礙的修復劑，其對蔬菜作物生長特性、土壤養(yǎng)分含量以及土壤微生物區(qū)系特征有一定的影響［2,10］。已有的研究也表明，施用生物炭或枯草芽孢桿菌可促進辣椒植株的生長［10-11］。本研究將枯草芽孢桿菌負載于生物炭上，將此修復材料施用于辣椒連作的土壤中，結(jié)果顯示負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭在開花期不僅可顯著促進辣椒植株的生長，并且使辣椒開花和結(jié)果的時間提前。

此外，有研究表明枯草芽孢桿菌可以促進植物對氮素的吸收利用［16］。本研究表明，負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭處理的土壤硝態(tài)氮含量在整個生育期內(nèi)表現(xiàn)為幼苗期＞開花期＞成熟期，其中負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭處理的硝態(tài)氮在開花期顯著低于對照，說明負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭施用可促進辣椒對土壤氮素的吸收利用。這是因為生物炭為枯草芽孢桿菌S16 提供生存空間，提高其存活率，進而促進了辣椒對土壤氮素的吸收利用。眾所周知，一些有益微生物具有溶磷的功能，施用到土壤中可促進土壤中固定態(tài)磷的溶解，釋放到土壤中提高了土壤中有效磷含量［17］?？莶菅挎邨U菌作為農(nóng)業(yè)中常用的有益菌，具有一定的溶磷能力［18］。本研究的試驗結(jié)果表明負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭與對照相比在辣椒整個生育時期內(nèi)提高了土壤有效磷含量，并促進了辣椒對磷的吸收與植株生長。

土壤連作易導致土壤微生物群落結(jié)構改變，降低土壤細菌和放線菌數(shù)量，增加土壤病原真菌數(shù)量，土壤由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)變［19］。本研究結(jié)果表明負載枯草芽孢桿菌S16 的生物炭與對照相比在幼苗期可增加非根際土壤細菌數(shù)量，在開花期可降低根際土壤真菌數(shù)量，增加根際和非根際土壤放線菌數(shù)量，與Zhao［20］的研究結(jié)果一致，可能是由于生物炭所具有的孔隙結(jié)構為微生物提供了生存空間，促進枯草芽孢桿菌S16 的定殖，同時也為土著微生物提供生存空間，增加拮抗菌的數(shù)量，降低病原真菌的數(shù)量。此外，負載枯草芽孢桿菌S16 的木醋液改性生物炭與對照相比，降低了開花期根際和非根際土壤真菌數(shù)量，但同時也降低了苗期根際土壤細菌數(shù)量?？赡苁怯捎谀敬滓褐兴挠袡C成分在降低病原菌的同時也抑制了有益細菌的生長［12］。因此，負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭具有穩(wěn)定土壤微生物區(qū)系平衡的作用。

4 結(jié)論

（1）基施負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭不僅可促進連作土壤中辣椒植株的生長，并且可促進辣椒提前開花和結(jié)果。

（2）基施負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭提高了辣椒整個生育期土壤有效磷含量，降低了開花期土壤硝態(tài)氮含量。

（3）基施負載枯草芽孢桿菌S16 生物炭降低了開花期根際土壤真菌數(shù)量，增加了根際土壤放線菌數(shù)量，協(xié)調(diào)了根際土壤微生物群落，緩解了辣椒連作的土壤障礙。