左高雅，程宵婧，遇 潔，陰立錦，侯非凡，邢國明，李 森

（山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院/大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，山西 太谷 030801）

黃花菜（Hemerocallis citrina），又名忘憂草、金針菜，萱草屬多年生草本植物［1］。黃花菜的花蕾中含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、糖類、纖維素、卵磷脂、鈣、鐵、磷、硒等物質(zhì)，因此又是一種藥食兼用的特色蔬菜［2］。黃花菜在我國栽培歷史悠久，適應能力與繁殖能力強，其花形優(yōu)美，色澤艷麗，還可作為綠化觀賞的良好選擇。

我國是世界黃花菜種質(zhì)資源的分布中心，同時也是世界上黃花菜的主要生產(chǎn)地。在全國范圍內(nèi)，黃花菜種植地區(qū)主要集中分布于山西大同、陜西大荔、甘肅慶陽、湖南祁東、寧夏鹽池和四川渠縣等地，2020 年全國黃花菜共約100 萬畝，已成為發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的代表性作物［3］。長期以來，黃花菜產(chǎn)業(yè)缺乏育種研究，各個產(chǎn)區(qū)黃花菜品種單一，缺乏優(yōu)良品種。利用現(xiàn)代育種手段，培育新優(yōu)品種是促進產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的重要內(nèi)容之一。其中，選擇優(yōu)良株系，通過組織培養(yǎng)快速擴繁是實現(xiàn)黃花菜新優(yōu)品種快速推廣的重要途徑。前期本團隊及其他研究人員使用黃花菜的種子、葉片、花蕾、短縮莖［4-7］等作為外植體得到黃花菜的組培再生苗，但是受外植體取材時間、取材數(shù)量以及誘導愈傷組織的難易程度等因素影響，在實際生產(chǎn)中的應用還不廣泛。使用黃花菜的花葶作為外植體，材料豐富，取材容易，能在較短的時間內(nèi)誘導出大量愈傷組織并獲得再生苗，是作為黃花菜新優(yōu)品種工廠化育苗較為理想的方式。本研究以‘大同黃花’為例，以花葶為外植體探索黃花菜優(yōu)良單株快速擴繁的技術(shù)，為今后黃花菜的遺傳轉(zhuǎn)化以及工廠化擴繁提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料來源于山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院萱草屬植物種質(zhì)資源圃的‘大同黃花’（Hemerocallis citrina cv.‘Datong Huanghua’），于6 月下旬晴天的中午采樣，選擇暫未開花較為幼嫩的花葶為外植體，摘除花蕾待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒接種方式 將‘大同黃花’花葶用自來水沖洗干凈后，放在無菌瓶中，在超凈工作臺中用無菌水沖洗1 次，然后用75% 酒精消毒30 s，再用無菌水沖洗2 次，接著用消毒劑進行消毒滅菌，最后再用無菌水沖洗5 次，以上消毒期間均不斷搖晃無菌瓶。消毒完成后用無菌鑷子夾出花葶，無菌濾紙吸干表面水分，無菌手術(shù)刀切除花葶兩端部分，將花葶沿橫截面切為0.5 cm 的小段，在形態(tài)學下端縱切一刀以創(chuàng)造更大傷口形成愈傷組織，吸干傷口流出的液體后將其形態(tài)學下端朝上接種于培養(yǎng)基中。

1.2.2 不同消毒劑及處理時間對花葶外植體的影響用含5%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液2 種消毒劑進行外植體的消毒滅菌，時間分別為5、10、15 min，每瓶接種5 個外植體，每個處理接種2 瓶，重復3 次。在培養(yǎng)室進行暗培養(yǎng)，15 d 后統(tǒng)計污染率及啟動率。

1.2.3 不同外植體儲存時間對愈傷組織誘導的影響花葶取樣后，沖洗表面污垢，將其放入盛有水的容器中，置于4℃冰箱中儲存，分別在取樣的當天、儲存2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 d 后接種，每瓶接種5 個外植體，每個處理接種2 瓶，重復3 次。在培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計出愈率。

1.2.4 不同激素配比對花葶外植體生長分化的影響將花葶接種于添加不同濃度6-BA（0、0.5、1.5、2.5 mg/L）和2,4-D（0、0.1、0.5、1 mg/L）的MS固體培養(yǎng)基中，每瓶接種5 個外植體，每個處理接種3 瓶，重復3 次。在培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計出愈率，然后轉(zhuǎn)為光照條件下培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計不定芽分化率。

1.2.5 生根培養(yǎng)及煉苗移栽 當誘導的不定芽長至3 cm 以上時，將不定芽單獨切分下來轉(zhuǎn)移到添加0.5 mg/L NAA 的生根培養(yǎng)基中，若不定芽長勢過密難以切分開，可以叢生芽的方式轉(zhuǎn)移。光照培養(yǎng)30 d 后觀察生根情況。將生長健壯，根系發(fā)達的無菌苗進行煉苗移栽，在組培室中擰松瓶蓋開小口煉苗3 d，取出并洗凈附著在苗根部的培養(yǎng)基，將叢生苗小心拆分成單株苗，移栽于草炭+珍珠巖+蛭石（體積比為3∶1∶1）的混合基質(zhì)中，澆足量水，并用小噴壺均勻噴施添加多菌靈和生根粉的1 000倍液，移栽后將苗盤放于半陰處緩苗，一周后再次噴施添加多菌靈和生根粉的1 000 倍液，轉(zhuǎn)移到全光照的正常環(huán)境下管理。共計煉苗移栽50 棵組培生根苗，試驗30 d 后統(tǒng)計成活率，觀察植株長勢。

1.3 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)容器均采用容量為200 mL 的玻璃組培瓶，每升培養(yǎng)基分裝35～40 瓶，培養(yǎng)基均添加4.3 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖，2 g/L 植物凝膠，培養(yǎng)基配制完成調(diào)節(jié)pH 為5.8～6.2，高壓蒸汽滅菌條件121 ℃，20 min。培養(yǎng)室條件為光照強度1 500～2 000 lx，光照時間16 h/d，培養(yǎng)溫度25±2 ℃。培養(yǎng)期間觀察到外植體出現(xiàn)污染時，及時將瓶內(nèi)其他未污染的外植體轉(zhuǎn)入新鮮的培養(yǎng)基中。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 進行數(shù)據(jù)處理；SPSS 23.0 進行差異顯著性分析和多重比較。

污染率=（污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%

啟動率=（萌動的外植體數(shù)/接種的無污染的外植體數(shù)）×100%

出愈率=（形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的無污染外植體數(shù)）×100%

不定芽分化率=（愈傷組織分化不定芽的外植體數(shù)/形成愈傷組織的外植體數(shù)）×100%

成活率=（移栽后成活的組培苗數(shù)/移栽的組培苗數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑及處理時間對花葶外植體的影響

外植體接種（圖1A）后，一般在2～10 d 內(nèi)可以觀察到污染現(xiàn)象，從表1 可以看出，不同消毒滅菌方式和時間處理后花葶外植體的污染率和啟動率都有顯著差異，在75%酒精、5%次氯酸鈉溶液配合滅菌和75%酒精、0.1%升汞溶液配合滅菌2 種消毒滅菌方式中，隨著滅菌時間的延長，外植體污染率和啟動率均有所下降，說明消毒劑可有效消除外植體表面雜菌，同時隨著時間的延長會對外植體產(chǎn)生毒害作用。當0.1%升汞溶液滅菌5 和10 min時，外植體污染率較低且2 個處理沒有顯著差異，但從外植體的啟動（圖1B）來看，滅菌10 min 對外植體的毒害作用更大，不利于后續(xù)試驗的開展。因此綜合考慮污染率和啟動率2 個方面的因素，適宜的消毒滅菌步驟應為先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞溶液滅菌10 min，可將污染率降低至16.67%，啟動率達到88.43%。

表1 不同消毒處理對愈傷組織污染率和啟動率的影響Table 1 Effects of different disinfection treatments on callus contamination rate and initiation rate

圖1 ‘大同黃花’花葶組織培養(yǎng)脫分化過程Fig.1 Dedifferentiation process of scape tissue culture of Hemerocallis citrina cv. ‘Datong Huanghua’

2.2 不同外植體儲存時間對愈傷組織誘導的影響

4 ℃冰箱中儲存的過程中，花葶放入保持有水的容器狀態(tài)下，20 d 內(nèi)并無萎蔫或干枯現(xiàn)象。接種暗培養(yǎng)30 d 后，從圖2 中可以看出，隨著儲存時間的延長，外植體的出愈率逐漸降低，花葶儲存時間為0、2、4、6 d 時得到的出愈率均無顯著差異，可得到正常愈傷組織；儲存時間超過12 d 后，出愈率會下降一半；儲存時間為16 d 以后時，得到的出愈率均無顯著差異，幾乎不再產(chǎn)生愈傷組織；儲存18 d后，外植體出愈率為0。因此，花葶取材后在6 d 內(nèi)接種效果最佳。

圖2 不同外植體儲存時間對愈傷組織誘導的影響Fig.2 Effect of different storage time of explants on callus induction

2.3 不同植物激素配比對花葶外植體生長分化的影響

暗培養(yǎng)30 d 后，花葶的切口部位產(chǎn)生白色的愈傷組織（圖3A），從表2 中可以看出，在不添加6-BA 的培養(yǎng)基中無任何愈傷組織的出現(xiàn)，添加0.5～2.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生愈傷組織，添加1.5 mg/L 6-BA 或2.5 mg/L 6-BA 時，隨著2,4-D 的濃度增大，出愈率反而降低，且添加了2.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上得到最大出愈率，這與添加1.5 mg/L 6-BA，2.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L 2,4-D，2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2,4-D 后的培養(yǎng)基得到的出愈率均無顯著差異。當由暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)后，白色的愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色（圖3B），接著產(chǎn)生芽點進而分化出不定芽（圖3C），從表2 中可以看出，添加了2.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基中得到最大的不定芽分化率，這與添加1.5 mg/L 6-BA，1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2,4-D，2.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L 2,4-D后的培養(yǎng)基得到的不定芽分化率均無顯著差異?？梢?，‘大同黃花’花葶外植體在只添加6-BA 的培養(yǎng)基中也可誘導出愈傷組織和分化不定芽，并且隨著時間的延長，在不添加6-BA 的培養(yǎng)基中花葶外植體最終褐化死亡（圖4A），添加2.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中芽分化情況相對來說更好（圖4B、C）。因此綜合考慮出愈率和不定芽分化率，選擇添加激素濃度為2.5 mg/L 6-BA 的MS 培養(yǎng)基可獲得最多愈傷組織和不定芽。

圖4 不同植物激素配比下芽分化情況Fig.4 Bud differentiation under different plant hormone ratios

表2 不同植物激素配比對外植體生長分化的影響Table 2 Effects of different plant hormone ratios on the growth and differentiation of explants

圖3 ‘大同黃花’花葶組織培養(yǎng)再分化過程Fig.3 Redifferentiation process of scape tissue culture of Hemerocallis citrina cv. ‘Datong Huanghua’

2.4 生根培養(yǎng)及煉苗移栽

將分化的不定芽（圖5A）轉(zhuǎn)入添加0.5 mg/L NAA 的生根培養(yǎng)基后，15 d 后陸續(xù)從無根苗的基部出現(xiàn)乳狀突起，之后出現(xiàn)白色或黃色的根毛，30 d后形成完整再生植株（圖5B），經(jīng)過煉苗移栽30 d后，組培苗成活數(shù)量為47 棵，成活率為94.00%，植株生長狀態(tài)良好（圖5C）。

圖5 再生植株形成Fig.5 Regeneration plantlet formation

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，污染關(guān)系著植物體能否正常生長發(fā)育和后續(xù)操作能否正常進行，污染的原因主要有操作環(huán)境不清潔造成的污染、接種人員操作不當造成的污染、培養(yǎng)環(huán)境不清潔造成的污染以及外植體自身的污染源［8］，從田間采取的花葶外植體表面常含有大量雜菌，因此接種前選用合適的消毒劑進行滅菌是確保外植體表面無菌的不可缺少的步驟，且消毒時間過短會使消毒不徹底，對雜菌的抑制效果不明顯［9］，必要時還可對外植體進行二次滅菌［10］，時間過長會產(chǎn)生毒害作用導致植物體細胞破裂、加劇褐化程度［11］，使其不能正常生長發(fā)育。在萱草屬植物的組織培養(yǎng)中，常用的消毒劑有酒精、次氯酸鈉、升汞、過氧化氫、福爾馬林等。本試驗采用75%酒精配合5%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液對花葶外植體消毒滅菌，結(jié)果表明，0.1%升汞溶液滅菌效果要好于5%次氯酸鈉溶液滅菌效果，0.1%升汞滅菌10 min 時外植體污染率較低，且對外植體啟動出愈影響不大，故采用75%酒精滅菌30 s 配合0.1%升汞滅菌10 min 為‘大同黃花’花葶的適宜消毒滅菌方法。除外植體的嚴格消毒外，平時需要定期對操作間及培養(yǎng)室紫外線燈照射消毒、酒精噴霧降塵消毒或用福爾馬林熏蒸消毒以排除環(huán)境污染［12］，接種人員需要嚴格規(guī)范組織培養(yǎng)中各項操作環(huán)節(jié)。

黃花菜的花期主要集中于每年的6 月下旬至7月下旬［13］，而可用于組織培養(yǎng)的幼嫩花葶所采集的時間段可能還不足一個月，因此黃花菜花葶外植體的取材受花期和季節(jié)的限制，研究黃花菜取材后的儲存對于工廠化生產(chǎn)來說十分重要?？紤]到新鮮花葶大量取材后如不能及時接種，在常溫下保存又容易萎蔫失去分化能力，將其放入4 ℃冰箱中儲存具有保存所需條件簡單、對材料的要求及處理過程簡單的優(yōu)點［14］。劉靜等［15］研究發(fā)現(xiàn)茶樹種子經(jīng)過一段時間4 ℃冷藏處理后，種子萌發(fā)率遠高于常溫儲存。本試驗中發(fā)現(xiàn)將新鮮花葶外植體在4 ℃冰箱中儲存2、4、6 d 之后接種與未經(jīng)儲存的新鮮花葶接種所得到的出愈率沒有顯著差異，說明這樣的儲存條件在延長外植體生命活力的同時也保持了其分化能力，但是隨著時間的延長，接種后未產(chǎn)生愈傷組織的外植體均在切口處產(chǎn)生褐化，這可能由于低溫導致的外植體酶促褐變的生理現(xiàn)象［16］。

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物組織培養(yǎng)與離體再生的重要因素之一，植物生長調(diào)節(jié)劑種類、劑量的選擇以及不同植物生長調(diào)節(jié)劑間的配比的選擇是探討高效率進行植物愈傷組織誘導和分化的關(guān)鍵所在［17］。在黃花菜的組織培養(yǎng)中，常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有生長素類NAA，2,4-D，IAA 等，細胞分裂素類6-BA，KT 等，王靜等［18］以幼葉為外植體在添加2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基中誘導出大量愈傷組織；范銀燕等［19］在添加2 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中以花葶為外植體愈傷組織誘導率最高，以添加 1mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培養(yǎng)基為芽分化培養(yǎng)基；韓志平等［20］以種子為外植體在添加2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中誘導分化成芽，在添加0.2 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上壯苗生根。本試驗中發(fā)現(xiàn)‘大同黃花’花葶愈傷組織誘導不需要生長素類激素的參與，在僅添加2.5 mg/L 6-BA的MS 培養(yǎng)基中可形成大量愈傷組織，并且不需要更換培養(yǎng)基配方即可分化成芽，甚至在同一培養(yǎng)基配方繼代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)有少量芽可直接生根，這種“一步成苗”現(xiàn)象在組織培養(yǎng)中十分少見，可節(jié)約成本、簡化操作步驟，具有很大的研究意義。然而本試驗中用到的6-BA 濃度最大為2.5 mg/L，至于影響花葶外植體出愈及分化的最佳濃度范圍還有待研究。