陳欽亮，汪洋，李先根，周貝，王丹

（武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

肝臟是機體內(nèi)物質(zhì)代謝的主要器官，也是機體內(nèi)最大的解毒場所。然而，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中許多因素（如病菌感染、應(yīng)激和飼料毒素殘留）會導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)破壞、功能紊亂以及肝細胞死亡。肝臟損傷會導(dǎo)致仔豬生產(chǎn)性能下降，并還會增加疾病的發(fā)生率，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失。

肝臟損傷伴隨著肝細胞的死亡。程序性壞死是一種非依賴性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的細胞死亡方式。死亡細胞具有壞死細胞的典型特征，表現(xiàn)為細胞和細胞器體積腫大、線粒體擴大崩解、溶酶體膜破壞、核膜破裂和溶解、碎核涌出細胞，引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。程序性壞死信號通路主要的分子包括受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）、RIP3 和混合系列激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL）。程序性壞死在肝臟損傷和肝細胞的死亡中起著重要作用。如在肝損傷和肝纖維化等過程中，肝細胞會發(fā)生明顯的程序性壞死；丙型肝炎病毒引起的肝損傷中，肝細胞壞死伴隨著凋亡和程序性壞死的發(fā)生。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，通過刺激單核-巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-（TNF-）、白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）等細胞因子損傷肝臟。然而，程序性壞死是否介導(dǎo)LPS 誘導(dǎo)的仔豬肝臟損傷并不清楚。因此，本試驗采用腹膜注射LPS 構(gòu)建仔豬肝臟損傷模型，旨在探究LPS 刺激對仔豬肝臟形態(tài)及程序性壞死信號通路的影響，為揭示程序性壞死在肝臟損傷中的作用奠定理論基礎(chǔ)，并為肝臟疾病的治療提供新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 LPS：大腸桿菌血清型O55:B5，純度>99%，為Sigma-Aldrich 化學(xué)公司產(chǎn)品；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 試劑盒均為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗設(shè)計 選取12 頭平均體重為（7.1±0.9）kg28 日齡杜×長×大三元斷奶仔豬，隨機分為對照組和LPS 組，每組6 頭。所有仔豬單籠飼養(yǎng)并自由飲水、采食，預(yù)試14 d 后，LPS 組腹膜注射100 μg/kg BW 的LPS，對照組注射等量的生理鹽水。注射LPS 4 h 后，從仔豬前腔靜脈采血10 mL，靜置15 min 后，離心（3 000 r/min，10 min）分離血漿，-80℃冰箱保存。將仔豬麻醉屠宰，取肝臟組織一小塊，用于肝臟組織形態(tài)學(xué)的觀察（4%多聚甲醛固定，然后HE 染色）。再取適量的肝臟組織，低溫生理鹽水沖洗干凈，剪碎，包入無菌錫箔紙中，放入液氮中凍存，最后轉(zhuǎn)移到-80℃的冰箱保存待測。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織形態(tài)學(xué)切片采用HE 染色，主要包括脫蠟、染色、脫水、透明及封片等步驟。具體操作參照萬志成的試驗方法。

1.3.2 透射電鏡分析 將固定于2.5%戊二醛的肝臟組織樣品，通過處理后進行電鏡觀察，測定方法參照。

1.3.3 肝功能指標(biāo) 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）的活性采用日立7020全自動生化分析儀測定，按照試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）說明書操作。

1.3.4 肝臟炎性細胞因子以及程序性壞死信號通路相關(guān)基因mRNA 表達量 提取肝臟組織總RNA，按照Prime Script RT reagent kit 試劑盒（貨號RR047A）步驟將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采 用SYBRPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）real-time PCR 試劑盒（貨號RR420A）。使用-作為內(nèi)參對照，采用Livak 等的2法計算目的基因的mRNA 相對表達量。、自殺相關(guān)因子死亡結(jié)構(gòu)域（）、c、磷酸甘油酸變位酶5（）、動力相關(guān)蛋白1（）、高遷移率族蛋白1（），基因的引物序列見。

1.3.5 肝臟程序性壞死信號通路關(guān)鍵蛋白表達量 取肝臟樣品100～150 mg，使用RIPA 組織裂解液分層提取總蛋白，收集上清液并采用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。然后將一定量的蛋白質(zhì)用10% SDSPAGE 凝膠分離并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。脫脂奶粉封閉后采用一抗孵育12 h。特異性一抗包括兔抗RIP1（#LSB8214，LifeSpan BioSciences）、兔抗RIP3（#SC-135170，Santa Cruz Biotechnology）、兔 抗MLKL（#37705，Cell Signaling Technology）和鼠抗-actin（A2228，Sigma-Aldrich）。將膜清洗幾次后，加入IgG 常溫孵育2 h，使用ECL 化學(xué)發(fā)光液進行顯色。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行獨立樣本檢驗分析，統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。以<0.05 表示差異顯著。0.05<≤0.10 為具有顯著性趨勢。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激對仔豬肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 由圖1 可見，與對照組相比，LPS 組的肝臟組織有不同程度損傷，具體表現(xiàn)在肝細胞索紊亂，炎性細胞浸潤，肝細胞核溶解、固縮，肝細胞空泡化。

圖1 LPS 刺激對斷奶仔豬肝臟形態(tài)的影響（HE ×100）

2.2 LPS 刺激對仔豬肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響 由圖2 可知，與對照組相比，LPS 組的肝臟組織超微結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，具體表現(xiàn)在肝細胞核膜破裂、染色質(zhì)外溢、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、線粒體膜破裂、線粒體溶解及線粒體自噬等現(xiàn)象。

圖2 LPS 刺激對斷奶仔豬肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響（5 000×）

2.3 LPS 刺激對仔豬肝功能的影響 由表1 可知，與對照組相比，注射LPS 后血漿中AST/ALT 升高（=0.009），堿性磷酸酶（ALP）活性有升高趨勢（=0.079），而LPS 對AST 和ALT 活性則無顯著影響。

表1 LPS 刺激對仔豬肝功能指標(biāo)的影響

2.4 LPS 刺激對仔豬肝臟組織炎性細胞因子mRNA 表達量的影響 由表2 可知，與對照組相比，LPS 組肝臟組織中的炎性細胞因子和的mRNA含量均升高（<0.05）。

表2 LPS 刺激對仔豬肝臟炎性細胞因子mRNA 的影響

2.5 LPS 刺激對仔豬肝臟組織細胞程序性壞死信號通路相關(guān)基因mRNA 表達量的影響 由表3 可知，與對照組相比，注射LPS 誘導(dǎo)大多數(shù)細胞程序性壞死信號通路相關(guān)基因mRNA 表達上調(diào)，其中mRNA 表達量升高（<0.05）；而mRNA 表達量無顯著變化。

表3 LPS 刺激對仔豬肝臟程序性壞死信號通路相關(guān)基因mRNA 表達量的影響

2.6 LPS 刺激對仔豬肝臟組織程序性壞死信號通路關(guān)鍵蛋白表達量的影響 由圖3 可知，與對照組相比，LPS組中肝臟細胞程序性壞死信號通路關(guān)鍵蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 蛋白表達量均升高（<0.05）。

圖3 LPS 刺激對斷奶仔豬肝臟程序性壞死信號通路關(guān)鍵蛋白的影響

3 討 論

本試驗采用LPS 建立仔豬肝臟損傷模型，該模型是目前比較成熟的肝臟損傷模型。研究表明，LPS 刺激后3～6 h，肝臟組織可表現(xiàn)出嚴重損傷和功能紊亂，這些損傷伴隨著大量炎性細胞因子（TNF-、IL-1和IL-6）的產(chǎn)生；在多種肝臟損傷中，常伴隨著炎癥的發(fā)生，劇烈的炎癥反應(yīng)會引起細胞程序性壞死的發(fā)生。因此，LPS 在誘導(dǎo)肝臟急性炎癥時，也可能會誘導(dǎo)肝細胞的程序性壞死。

AST 和ALT 主要分布在肝臟、腎臟等組織中。機體健康時，血清中AST 含量較低，當(dāng)組織出現(xiàn)損傷、細胞受到破壞時，細胞膜通透性增加，AST 就會進入血液中，故血清中AST 的濃度常作為肝臟炎癥及損傷的重要指標(biāo)。有研究表明，機體只要有少量的肝細胞破壞，血清中ALT 活性即可增加1 倍，因此，ALT 也是急性肝細胞損傷最敏感的標(biāo)志。此外，血液中AKP 活性也是反映肝臟損傷的重要指標(biāo)。本試驗中，仔豬注射LPS 后能顯著誘導(dǎo)血漿中AKP 以及AST/ALT 升高。此外，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)切片也發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后肝臟組織有不同程度損傷，具體表現(xiàn)在肝細胞索紊亂，炎性細胞浸潤，肝細胞核溶解、固縮，肝細胞空泡化嚴重。課題組前期研究也證實，LPS 刺激4 h 后，仔豬肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常，肝細胞壞死，淋巴組織增生，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂。結(jié)合肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和肝功能的敏感指標(biāo)，證實LPS 能誘導(dǎo)仔豬的肝臟損傷。TNF-是主要由單核巨噬細胞分泌的一種細胞因子，在炎癥、感染、組織損傷、癌癥發(fā)生中起關(guān)鍵作用。IL-6 和IL-1是由單核細胞、內(nèi)皮細胞等在應(yīng)答感染、炎癥時產(chǎn)生的細胞因子，它們參與機體的免疫反應(yīng)及多種生理和病理過程。研究表明，這些炎性細胞因子的過量產(chǎn)生會導(dǎo)致機體組織（如肝臟）損傷。本試驗中，注射LPS 后肝臟組織炎性細胞因子TNF-、IL-6 和IL-1mRNA 表達量顯著升高。周滔等研究發(fā)現(xiàn)，LPS能誘導(dǎo)肝細胞對炎癥介質(zhì)和細胞因子的敏感性增加，而內(nèi)源性和外源性內(nèi)毒素的增加會導(dǎo)致肝臟枯否細胞的活化，分泌大量炎癥介質(zhì)與細胞因子。與CCl4 模型導(dǎo)致的肝損傷相比，LPS 模型的小鼠肝功能損傷較重，肝臟損傷中肝細胞的凋亡與程序性壞死都會發(fā)生，同時會引起肝臟的出血。這些結(jié)果表明LPS 造成了嚴重的肝臟損傷和炎癥的發(fā)生。

為了研究炎癥是否誘發(fā)細胞啟動程序性壞死調(diào)節(jié)機制，進一步檢測了程序性壞死信號通路相關(guān)基因mRNA 和蛋白的表達量。目前，對死亡受體介導(dǎo)的程序性壞死的研究最為深入。Caspase-8 被抑制的細胞受到刺激時可能引起細胞程序性壞死的發(fā)生，如TNF誘導(dǎo)zVAD-fmk 處理過的小鼠成纖維細胞L929 發(fā)生程序性壞死，還能使caspase-8 缺失的白血病細胞發(fā)生程序性壞死。因此，程序性壞死可能是在凋亡無法正常啟動時，細胞用來執(zhí)行的死亡方式，TNF 死亡通路起始于配體與受體的結(jié)合，參與這一通路的受體主要為死亡受體家族，包含死亡結(jié)構(gòu)域TNFR1 等受體，TNF-與其受體TNFR1 結(jié)合后，通過信號調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)形成包含F(xiàn)ADD 和caspase-8 等蛋白的復(fù)合體。在此復(fù)合體中，如果caspase-8 切割RIP1、RIP3 使其失活，細胞就通過凋亡的方式死亡；如果caspase-8 被抑制，RIP1、RIP3 通過磷酸化MLKL 的方式啟動細胞程序性壞死。大多數(shù)學(xué)者認為，激活的MLKL 聚集PGAM5，作用于DRP1 蛋白，引發(fā)線粒體的斷裂和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細胞程序性壞死。本試驗中，注射LPS 后肝臟程序性壞死信號通路大多數(shù)基因（如）的mRNA 表達量都顯著升高，表明LPS 刺激激活了肝臟細胞程序性壞死。Long 等研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死在促進腫瘤細胞死亡、抗病毒感染上有很好的應(yīng)用，抑制細胞程序性壞死還能減少心梗等疾病帶來的損傷。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，感染、炎癥、應(yīng)激等都可導(dǎo)致細胞程序性壞死，激活相關(guān)信號通路，最終導(dǎo)致組織損傷和功能障礙。這些研究提示，抑制程序性壞死可能是緩解LPS 誘導(dǎo)肝臟損傷的重要調(diào)控策略。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，LPS 刺激可導(dǎo)致肝臟分泌大量炎性細胞因子，激活細胞程序性壞死信號通路，引發(fā)肝臟組織程序性壞死的發(fā)生，導(dǎo)致仔豬肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷。