李 锘，高德英，曹佳雯，孫小寶，何波,3，王佳堃，王謙*

(1.浙江大學動物科學學院奶業(yè)科學研究所，浙江杭州 310058；2.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315100；3.上海交通大學生命科學技術學院微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240)

-葡聚糖是一類由--葡萄糖殘基通過-1，3 和-1，4-糖苷鍵連接形成的線性多聚糖。作為一類非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide，NSP），-葡聚糖是植物性飼料中一種重要的抗營養(yǎng)因子，它粘稠性高且難降解，難以被單胃動物消化吸收利用，導致動物生產(chǎn)性能降低及飼料利用率下降。-葡聚糖酶是指能降解-葡聚糖的一大類糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），可作為飼料添加劑、多糖改性增溶劑等應用于飼料和食品工業(yè)。-葡聚糖酶能夠消除-葡聚糖的抗營養(yǎng)作用，同時，-葡聚糖的降解產(chǎn)物主要是聚合度為2～5 的低聚纖維寡糖，這些功能性寡糖能作為益生元促進消化道有益微生物的增殖，維持動物和人體健康。

目前，-葡聚糖酶主要從環(huán)境微生物中分離純化或克隆后異源表達獲取。瘤胃微生物能夠產(chǎn)生包括-葡聚糖酶在內(nèi)的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）。由于長期適應于瘤胃特殊的生長環(huán)境，絕大多數(shù)瘤胃微生物不能被純培養(yǎng)，因此采用常規(guī)方法難以直接從中獲取-葡聚糖酶。課題組前期采用宏轉錄組學技術從湖羊瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)436 個GH5 家族編碼基因。本研究進一步擴增并異源表達-葡聚糖酶基因，分析重組蛋白的酶學性質、動力學參數(shù)和水解產(chǎn)物，為高效降解植物性飼料和飼用酶制劑研發(fā)建立基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 表達載體pET-28a（+）購自Novagen 公司；Super Pfx 聚合酶購自康為世紀公司；ClonExpressII One step Cloning Kit 購自Vazyme 公司；質粒提取試劑盒購自Omega 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、割膠回收試劑盒購自上海生工公司；大麥葡聚糖、苔蘚地衣多糖和纖維寡糖購自Megazyme 公司；核酸與蛋白Marker、Ni-NTA agarose、卡那霉素（kanamycin，Kan）和異丙基---硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自上海生工公司；湖羊瘤胃內(nèi)容物樣品和原核表達宿主Escherichia coli BL21（DE3）為本實驗室保存。

1.2 重組工程菌構建與蛋白表達 參照何波的方法提取湖羊瘤胃內(nèi)容物總RNA 并反轉錄成cDNA。利用IDSGluc5-31-HI（5'ACAGCAAATGGGTCGCGGAT CCATGCAGCGTATCAAAATCTTAGCG3'）和IDSGluc5-31-I（5'CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAT GCCGCAGGCGCTTCC3'）引物（下劃線為表達載體同源臂序列）和Super Pfx 聚合酶擴增cDNA 樣品。純化后的PCR 產(chǎn)品與經(jīng)H I 和RI 雙酶切的pET-28a（+）充分混合 后，利用ClonExpressII One step Cloning Kit 進行同源重組，BL21（DE3）感受態(tài)細胞用于反應產(chǎn)物的熱激轉化，轉化完成后涂布含50 μg/mL Kan 的LB 平板。37℃培養(yǎng)16～20 h 后，挑取單菌落進行菌落PCR 擴增，并提取質粒送至上海生工公司測序。

利用1 mmol/L IPTG 誘導工程菌BL21/pET28a/表達重組葡聚糖酶，在16℃，100 r/min下孵育16 h 后，收集菌體。按本課題組前期建立的方法，進行均質破碎獲得粗酶液。

1.3 蛋白純化與電泳分析 將親和Ni-NTA agarose 填料按1:100 與上述粗酶液混合，加入終濃度為20 mmol/L的咪唑，冰上緩慢震蕩孵育1 h。接著利用含20～500 mmol/L 咪唑的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫目標蛋白。之后，利用Millipore AmiconUltra 超濾柱（3 ku）去除殘余咪唑獲得純化蛋白，用于SDS-PAGE 電泳和酶譜分析。

酶譜分析是在聚丙烯酰胺凝膠中加入終濃度為0.5% 的葡聚糖或地衣多糖底物，在最適反應條件下測 定IDSGLUC5-31 對底物的 降解活性。將20 μL IDSGLUC5-31 純化酶液與5 μL 5×SDS 上樣緩沖液充分混勻，于4℃下放置20 min。蛋白上樣量為10 μL，以BSA 為陰性對照。90 V 恒壓電泳40 min，120 V 恒壓電泳2 h。電泳結束后，將凝膠置于25%異丙醇中復性3 次，每次10 min。復性后的凝膠置于1×PBS 緩沖液中，37℃反應過夜。用0.1%剛果紅染色20 min，之后用1 mol/L NaCl 溶液中至脫色完全。

1.4 酶學性質分析 采用3，5 二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法測定葡聚糖酶活性，采用Bradford 法測定蛋白濃度，操作方法：將20 μL IDSGLUC5-31 純化酶液（約13 μg，下同）與50 μL 0.5%葡聚糖底物充分混合，在相應溫度或pH 條件下反應15 min 后，加入70 μL DNS 試劑，99℃保溫10 min。冷卻至室溫后，使用SpectraMax M3 酶標儀（Molecular Devices）測定OD，同時設置熱處理失活的酶為對照和3 組平行試驗。

1.4.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性 測定IDSGLUC5-31 在pH6.0，20～90℃范圍內(nèi)的反應活性，以最高活性時的溫度為最適溫度，計算各溫度條件下相對活性。熱穩(wěn)定性分析是在pH6.0 條件下，將酶液分別在40～60℃下保 溫60 min。在0、5、10、20、30、40 和60 min 取樣，pH6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應起始點為100%，計算各試驗組的殘余酶活。

1.4.2 最適pH 和pH 穩(wěn)定性 測定IDSGLUC5-31 在40℃，pH 2.2～10.6 緩沖液（檸檬酸/磷酸緩沖液pH 2.2～8.0；碳酸鈉/ 碳酸氫鈉緩沖液pH 8.9～10.6）范圍內(nèi)的反應活性，以最高活性時的pH 為最適pH，計算各pH 條件下相對活性。pH 穩(wěn)定性分析是在40℃下，將酶液分別在4℃ pH 2.2～10.6 緩沖液中孵育30 min，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應起始點為100%，計算各實驗組的殘余酶活。

1.4.3 金屬離子及化學試劑耐受能力 將IDSGLUC5-31 與0.1～10 mmol/L 的金屬離子（Na、Ca、Mg或Cu）或其他化學試劑（SDS 或EDTA）在4℃下保溫30 min，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應起始點為100%，計算殘余酶活。

1.4.4 動力學參數(shù) 將IDSGLUC5-31 分別與0.5～10 mg/mL的葡聚糖、地衣多糖、羧甲基纖維素、微晶纖維素、磷酸溶脹纖維素、糊精或木聚糖底物充分混合，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。利用GraphPad Prism 8 軟件（San Diego，CA）計算和。

1.5 底物水解分析

1.5.1 薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）采用TLC 法分析IDSGLUC5-31 催化葡聚糖底物的水解產(chǎn)物。將5 mg/mL 的大麥葡聚糖或地衣多糖底物置于40℃下預熱5 min，加入1 μg IDSGLUC5-31，40℃，pH 6.0 反應0.5 h 和20 h 后分別取樣1 mL，95℃孵育30 min 終止反應。4℃，13 000 r/min 離心30 min，取0.3 μL 反應液或1.0 mg/mL 標準品混合液（含葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖）輕輕點在薄層板（Merck 公司）上，重復上樣5 次。流動相為正丁醇:乙酸:水體積比為2:1:1，展開到距薄層板頂端1 cm 處取出，置于通風櫥待平板充分干燥后，置入展層液中二次展開，再干燥后放入顯色液（硫酸：甲醇=5:95，v/v；0.5%-萘酚，w/v）反應2 min，100℃ 10 min高溫顯色。

1.5.2 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chrom atography，HPLC） 進一步采用HPLC法分析IDSGLUC5-31催化葡聚糖底物的水解產(chǎn)物。取2 mL IDSGLUC5-31純化酶液（約120 μg）分別與5 mL 0.5%葡聚糖或0.5%地衣多糖底物混合，在最適反應條件下孵育20 h，分別于8 h 和20 h 取樣。于95℃保溫30 min，13 000 r/min離心15 min，取上清，設置3 組重復試驗。利用Asahipak NH2P-50 4E 色譜柱（Shodex 公司）和LC-1200 高效液相色譜儀（Agilent 公司），流動相為乙腈:水=65:35，柱溫40℃，流速0.8 mL/min，采用RID-20A 時差折光檢測器分析底物水解樣品。

1.6 統(tǒng)計分析 圖片繪制和動力學分析用Graphpad Prism 8 完成，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Student's-test。* 表示差異顯著（<0.05）；**表示差異極顯著（<0.01）。

2 結果與分析

2.1 葡聚糖酶序列分析 本試驗成功地從湖羊瘤胃未培養(yǎng)微生物cDNA 中擴增得到1 個葡聚糖酶基因，其開放閱讀框長度為1 245 bp，編碼415 個氨基酸。該蛋白理論等電點為4.89，理論分子量為46.6 ku（https://web.expasy.org/compute_pi/）。SingalP 5.1和Pfam 分析顯示，IDSGLUC5-31 蛋白包含一段24個氨基酸的信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），成熟肽中包含1 個GH5 家族催化結構域（http://pfam.xfam.org/）。同源建模分析顯示（圖1），該蛋白包含（/）桶狀催化結構域，呈現(xiàn)GH5 家族的典型結構特征（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）。

圖1 IDSGLUC5-31 蛋白三維結構預測

系統(tǒng)發(fā)育進化樹和BLAST 分析表明，IDSGLUC5-31與梭菌目細菌（GenBank No:SNT95308.1）來源的GH5 家族蛋白聚成一簇（圖2），氨基酸序列相似性分別為78.27%，該蛋白的功能與性質未被研究。通過序列比對分析IDSGLUC5-31 的成熟肽與QTE70932.1、MEB6847130.1、MBD5081498.1、WP051109229.1 等具有保守的氨基酸序列，其中保守催化殘基區(qū)域E198和E332 與已報道的GH5 家族內(nèi)切葡聚糖酶的保守序列的規(guī)律一致（圖3）。

圖2 IDSGLUC5-31 系統(tǒng)進化樹分析

圖3 葡聚糖酶氨基酸序列比對

2.2 葡聚糖酶IDSGLUC5-31 異源表達與電泳分析 利用IPTG 誘導表達重組工程菌BL21/pET28a/，粗蛋白質經(jīng)Ni-NTA agarose 親和層析后，獲得分子量約為48 ku 的IDSGLUC5-31 蛋白（圖4-A）。進一步通過酶譜分析發(fā)現(xiàn)，IDSGLUC5-31 能有效降解大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖（圖4-B 和4-C）。

圖4 IDSGLUC5-31 SDS-PAGE 和酶譜分析

2.3 IDSGLUC5-31 的酶學性質 酶學性質分析顯示，IDSGLUC5-31 的最適反應溫度和pH 分別為40℃和6.0（圖5-A 和5-B）。在40℃以下較為穩(wěn)定，處理1 h 后，仍能保持79.95%的殘余活性。當溫度上升至50℃以上，該蛋白迅速失活。50℃下處理5 min，蛋白幾乎完全失活（圖5-C）。IDSGLUC5-31 在pH 5.0～7.0 較為穩(wěn)定，處理30 min 后仍能保持70%以上活性（圖5-D）。

圖5 IDSGLUC5-31 的酶學性質

2.4 IDSGLUC5-31 的動力學參數(shù) 活性底物譜分析顯示，IDSGLUC5-31 能高效催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多 糖，分別為508.7 和240.1 μmol/（min·mg）。且底物親和力較強，分別為1.725 和2.628 mg/mL（表1）。然而，該蛋白不能降解羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、磷酸溶脹纖維素、糊精或木聚糖。

表1 IDSGLUC5-31 動力學參數(shù)

2.5 金屬離子和化學試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響 不同類型和不同濃度金屬離子和化學試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響如圖6 所示，該蛋白對Na的耐受能力較強，經(jīng)0.1～10 mmol/L Na處理30 min后，活性幾乎沒有改變；低濃度（0.1 mmol/L）Ca、Mg或SDS 不影響IDSGLUC5-31 的催化活性。當濃度提高至10 mmol/L 時，蛋白活性下降（<0.01）；IDSGLUC5-31 在EDTA 和Cu存在的環(huán)境中穩(wěn)定性較差，經(jīng)孵育30 min 后活性迅速下降，甚至完全失活（<0.01），且伴有蛋白析出。

圖6 金屬離子和化學試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響

2.6 IDSGLUC5-31 水解多聚糖的產(chǎn)物分析 采用TLC法分析IDSGLUC5-31 水解地衣多糖和大麥葡聚糖的產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn)，IDSGLUC5-31 水解地衣多糖和大麥葡聚糖的主要產(chǎn)物為纖維二糖至纖維五糖，其中纖維三糖含量最高（圖7-A）。進一步利用HPLC 分析IDSGLUC5-31 催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖的水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：經(jīng)IDSGLUC5-31 處理20 h 后，大麥葡聚糖的水解產(chǎn)物為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖，產(chǎn)量分別為0.912、0.94、0.56 和0.24 mg/mL（圖7-B）；苔蘚地衣多糖的水解產(chǎn)物也為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖，產(chǎn)量分別為0.10、0.87、0.23 和0.1 mg/mL（圖7-C）。2 種底物的主要水解產(chǎn)物均為纖維三糖和纖維四糖，推測IDSGLUC5-31 是一種內(nèi)切-葡聚糖酶。

圖7 IDSGLUC5-31 水解產(chǎn)物分析

3 討 論

微生物純培養(yǎng)與無菌技術長期以來是微生物學研究的基石，但由于難以滿足來自瘤胃等極端環(huán)境微生物的生長需求，瘤胃微生物的純培養(yǎng)和相關功能基因的研究較為困難。宏基因組學和宏轉錄學技術改變了傳統(tǒng)純培養(yǎng)的理念，以樣本總DNA 或RNA 為研究對象，分析總微生物的功能基因與蛋白信息。Wang 等利用宏基因組學技術構建了娟珊牛瘤胃微生物的14 000 個fosmid 文庫，獲得120 個對碳水化合物底物具有水解活性的克隆，其中降解纖維素、木聚糖、淀粉和七葉苷底物的fosmid 克隆分別有34、52、1 和33 個，共編碼575 個潛在CAZymes 或與底物轉錄調控、轉運及信號傳導相關的功能基因。He 等利用宏轉錄組學技術從湖羊瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)的238 萬多個unigenes 中2.65%為糖苷水解酶，其中與纖維素降解相關的功能基因主要分布于GH3、5 和9 家族。這些研究表明，瘤胃微生物基因資源非常豐富，利用多組學技術能有效篩選、獲取CAZymes。

本研究從湖羊瘤胃微生物cDNA 中獲得的葡聚糖酶IDSGLUC5-31 的底物特異性好，對大麥葡聚糖酶、地衣多糖的催化活性和底物親和力均較高，然而，該蛋白的熱穩(wěn)定性不佳，在40?C 以上孵育后迅速失活。由于反芻動物瘤胃溫度通常為38～41?C，推測IDSGLUC5-31 的反應溫度可能是與消化道環(huán)境溫度相適應的結果。為便于運輸、提高適口性和飼料轉化率，飼用酶制劑在工業(yè)化生產(chǎn)中需要進行飼料制粒。根據(jù)制粒對象和工藝的不同，制粒溫度需達到80～90?C 甚至130?C 以上。而IDSGLUC5-31 在50℃下處理后就快速失活，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，后續(xù)可以通過定向進化、分子環(huán)化等酶工程手段進一步提升其熱穩(wěn)定性。

植物性飼料經(jīng)糖苷水解酶處理后，可以降解細胞壁中的NSPs，消除其抗營養(yǎng)作用，對肉雞、豬等單胃動物甚至奶牛、綿羊等反芻動物均具有促生長或提高生產(chǎn)性能的作用。本研究中，IDSGLUC5-31 可以催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖生成纖維三糖和纖維四糖，提示是一種內(nèi)切-葡聚糖酶。IDSGLUC5-31 一方面消除植物性飼料中葡聚糖的抗營養(yǎng)作用，另一方面產(chǎn)生的低聚寡糖可以作為益生元促進動物消化道中雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的定植，進而維持動物機體健康。

4 結 論

本研究將湖羊瘤胃微生物來源的葡聚糖酶基因進行異源表達獲得重組蛋白IDSGLUC5-31。該蛋白的最適反應溫度和pH 分別為40℃和6.0，且在40℃以下或pH5.0～7.0 內(nèi)較為穩(wěn)定，對0.1～10 mmol/L Na、0.1～1 mmol/L Ca或Mg表現(xiàn)較強耐受能力。此外，IDSGLUC5-31 能催化大麥葡聚糖或苔蘚地衣多糖生成纖維三糖和纖維四糖。本研究的結果為從瘤胃微生物中挖掘新型CAZymes 提供參考，并為研發(fā)飼用酶制劑和制備功能性寡糖建立基礎。