林 娟，紀竺青，曾申明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)可有效利用優(yōu)秀青年母豬及小母豬卵巢中大量的卵泡資源獲得早期胚胎，通過胚胎移植獲得大量優(yōu)秀后代，從而加速良種擴繁和新品種培育進程。然而，與牛、羊相比，豬體外受精（In vitro Fertilization，IVF）胚胎生產(chǎn)效率較低，其原因目前尚不清楚。豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)包括卵母細胞體外成熟、IVF 和胚胎體外培養(yǎng)3 個環(huán)節(jié)。其中最重要、影響最大的是IVF，盡管人們已采用多種方法來提高IVF胚胎的質(zhì)量，但體外生產(chǎn)的豬胚胎相較于體內(nèi)生產(chǎn)胚胎的發(fā)育能力仍存在較大差距。

單寧酸（Tannic Acid，TA）是一種天然多酚，由5 個鞣酸殘基共價連接到1 個中央葡萄糖而組成，它是一種有效的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑。TA作為單寧家族的一員，可抑制精子頂體釋放的透明質(zhì)酸酶活性，阻止卵丘-卵母細胞復(fù)合體（Cumulus-oocyte Complexes，COCs）胞外基質(zhì)水解過程，從而影響受精過程中精子在卵丘細胞間的遷移效率。研究表明，在豬受精培養(yǎng)液內(nèi)添加TA 可降低活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平以調(diào)節(jié)頂體反應(yīng)（Acrosome Reaction，AR），并可通過抑制IVF 過程中透明質(zhì)酸酶活性來阻止多精受精發(fā)生。本研究旨在探索受精液中精子密度和添加TA 對豬胚胎體外生產(chǎn)效率的影響，以期優(yōu)化豬IVF 技術(shù)參數(shù)從而提高整體生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬卵巢 豬卵巢取自沙河第五肉聯(lián)廠屠宰場，置于盛有30～32℃的雙抗-生理鹽水的保溫瓶中于2～3 h 內(nèi)運回實驗室。

1.1.2 豬冷凍精液 豬冷凍精液購自百鈞達科技發(fā)展（北京）有限公司，使用液氮罐運輸至實驗室。

1.1.3 試劑與藥品 除特殊說明外，本研究所有化學(xué)藥品均為Sigma（美國）公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬卵母細胞的收集與體外培養(yǎng) 運回實驗室的豬卵巢，剪除卵巢周圍組織并經(jīng)含雙抗-生理鹽水清洗后，用18 號針頭抽取卵巢表面直徑為3～6 mm 卵泡內(nèi)的COCs。經(jīng)HEPES 緩沖的Tyrode 溶液（HEPES-buffered Tyrode's Lactate，TL-HEPES）洗滌3 次，體視顯微鏡下挑取卵母細胞胞質(zhì)均勻且周圍包裹3 層及以上致密卵丘細胞的COCs，移入覆蓋礦物油的500 μL 卵母細胞成熟液中（80～100 枚/ 孔）培養(yǎng)44 h，卵母細胞體外成熟采用TCM-199（Invitrogen）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加10%（v/v）豬卵泡液、0.57 mmol/L 半胱氨酸、0.91 mmol/L 丙酮酸鈉、10 ng/mL 表皮生長因子、10 IU/mL 孕馬血清促性腺激素、10 IU/mL 人絨毛膜促性腺激素，培養(yǎng)條件為38.5℃、5% CO飽和濕度環(huán)境。

1.2.2 精子稀釋 凍精細管（2 億精子/管）從液氮中取出后迅速放入50℃水浴中解凍16 s，之后用4 mL TLHEPES 重懸，490×g 離心5 min，并用TL-HEPES 清洗2 次。將離心后的沉淀精子團用不同體積的改良Tris 緩沖液（Modified Tris-buffered Medium，mTBM）梯度稀釋至精子密度分別為（9.6±0.4）×10、（5.1±0.2）×10、（3.7±0.2）×10、（2.6±0.1）×10個/mL。體外受精之前，400 倍相差顯微鏡下檢測精子直線前進運動速率，使用解凍后活力達到80%的精子進行體外受精。

1.2.3 卵母細胞IVF 及胚胎培養(yǎng) COCs 體外成熟結(jié)束后，用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵母細胞周圍包裹的卵丘細胞，之后將每10 枚成熟卵母細胞置于45 μL 受精滴（mTBM）中。取5 μL 稀釋好的精液加入受精滴中，置于38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境下孵育。精卵孵育6 h 后，使用口吸管反復(fù)吸吹去掉精子后將受精卵轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液PZM-3 中繼續(xù)培養(yǎng)。體外受精當(dāng)日記為第0天，分別于培養(yǎng)第2 天和第7 天觀察卵裂率及囊胚率。

1.2.4 原核計數(shù) IVF 12 h 后將受精卵從培養(yǎng)箱中取出，4% 多聚甲醛進行固定30 min 以上，PBS 清洗1 次后放入含10 μg/mL 的Hoechst 33342 中室溫避光染色8～10 min。壓片后在熒光顯微鏡（X50，OLYMPUS，Japan）下進行原核觀察。具有2 個原核或1 個原核、1個解聚精子頭和2 個極體的合子被歸類為正常（單精子）受精。相反，含有2 個以上原核或1 個以上解聚精子頭的合子被認定為多精子受精。

1.2.5 考馬斯亮藍染色檢測精子AR 發(fā)生情況 按照文獻報道的方法，受精后2 h 使用口吸管在PBS 中反復(fù)吹打去掉卵子外的精子，PBS 中洗滌2 次后將精子置于4%多聚甲醛中室溫固定20 min。800×g 離心去掉上清后用1 mL 的100 mmol/L 乙酸銨（pH 9.0）洗滌2 次并重懸，之后取25 μL 精子懸液涂抹在載玻片上風(fēng)干。使用0.22%（w/v）考馬斯亮藍G-250 溶液（含50%（v/v）甲醇、10%（v/v）冰醋酸和40%（v/v）水）室溫染色2 min。自來水充分洗滌，風(fēng)干后立即置于顯微鏡下觀察。400 倍光鏡下隨機選擇總精子數(shù)不少于50 個的10 個視野采集圖像?？捡R斯亮藍染色后，精子頭部頂端頂體區(qū)著藍色者為未發(fā)生AR，不著色者為發(fā)生AR。

1.3 統(tǒng)計分析 除特殊說明外，各試驗至少重復(fù)3 次。采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析，若組數(shù)多于2 組則利用ANOVA 模塊分析進行方差分析，若只有2 組則采用獨立-test 進行分析。在ANOVA 模塊分析中使用Duncan's 多重比較來判斷差異顯著性。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 卵母細胞在不同精子密度的受精液中IVF 后胚胎發(fā)育結(jié)果 由表1 可見，受精液中精子密度為（5.1±0.2）×10個/mL 時卵裂率及囊胚率高于精子密度為（9.6±0.4）×10、（2.6±0.1）×10個/mL 組（<0.05），但與精子密度為（3.7±0.2）×10個/mL 組差異不顯著。依此結(jié)果，在后續(xù)IVF 試驗中選擇使用的精子密度為5.0×10個/mL 左右。

表1 卵母細胞在不同精子密度的受精液中IVF 后胚胎發(fā)育結(jié)果

2.2 受精液中添加不同濃度TA 時豬胚胎體外發(fā)育結(jié)果 由表2 可以看出，相比未添加組，添加5 μg/mL 和10 μg/mL TA 組卵裂率和囊胚率均提高（<0.05），且5 μg/mL 組囊胚率和囊胚細胞數(shù)高于10 μg/mL 組（<0.05）。因此，后續(xù)IVF 液中TA 濃度均為5 μg/mL。

表2 受精液中添加不同濃度TA 時豬胚胎體外發(fā)育結(jié)果

2.3 受精液中添加TA 時豬卵母細胞IVF 后原核形成情況 在正常情況下，豬卵母細胞在IVF 后12 h 形成原核，原核經(jīng)Hoechst 33342 染色后呈圓形或橢圓形（圖1，箭頭所示）。由表3 可以看出，與對照相比，5 μg/mL TA 組原核數(shù)為1 和2 的受精卵比率有升高的趨勢（>0.05），而含3 個及以上原核的受精卵占比略有下降（>0.05）。

圖1 Hoechst 33342 熒光染色后豬體外受精卵原核和精子形態(tài)

表3 受精液中添加TA 時豬卵母細胞IVF 后原核形成情況

2.4 受精液中添加TA 時豬精子AR 發(fā)生情況 考馬斯亮藍G-250 染色后顯微鏡下觀察，精子頭部頂端頂體區(qū)著藍色者為未發(fā)生AR（圖2A），不著色者為發(fā)生AR（圖2B）。由表4 可以看出，5 μg/mL TA 組受精2 h 后精子AR 發(fā)生比率低于對照組（<0.05）。

圖2 考馬斯亮藍G-250 染色后精子頂體形態(tài)

表4 受精液中添加TA 時豬精子AR 發(fā)生情況

3 討 論

豬體內(nèi)受精過程中大部分卵子都是單精受精（比率高達95%）。一般認為，透明帶反應(yīng)在阻止多精入卵過程中發(fā)揮極大的作用。在體內(nèi)，超過1 個精子穿透卵母細胞質(zhì)膜被定義為多精受精，它會導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育異?；蛱毫鳟a(chǎn)。受精液中適宜的精子密度對于體外成熟卵子的正常受精至關(guān)重要，因為精子與卵子比率決定了精子與卵子受精的機會，若IVF 過程中精子密度過高易造成多個精子入卵，而降低精子密度雖能在一定程度上避免多精入卵，但過低的精子密度會降低精子入卵的概率。本研究發(fā)現(xiàn)，在豬卵子IVF 過程中精子密度為5.0×10個/mL 左右時可獲得較高的卵裂率和囊胚率。Li 等研究也發(fā)現(xiàn)，豬卵母細胞體外受精過程中最佳精子密度為5×10個/mL。

受精過程中獲能精子在與卵母細胞接觸過程中會發(fā)生AR 并釋放多種酶。這些酶可幫助精子穿過卵丘細胞層和透明帶，最終促進精子與卵子結(jié)合。TA 作為天然多酚類植物提取物，具有抗突變、抗癌和抗氧化活性。近幾年，TA 被廣泛添加到豬和恒河猴卵母細胞的IVF 液中，切實起到了提高IVF 效率的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，豬IVF 液中添加5 μg/mL TA 可顯著提高卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)，同時降低精子AR 發(fā)生率。與Tatemoto 等報道結(jié)果不同，本研究結(jié)果顯示TA 添加對于阻止多精受精（即降低多原核受精卵形成比例）的作用與未添加組并無顯著差異，分析其原因在于本研究在IVF 過程中使用的是豬裸卵，而Tatemoto等使用的是COCs。值得注意的是，當(dāng)在豬卵母細胞體外成熟液和胚胎體外培養(yǎng)液中添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒后，再向IVF 液中添加TA，可顯著提高囊胚率并降低含3 個及以上原核的受精卵比率（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。這說明TA 發(fā)揮阻止多精受精的前提是卵母細胞質(zhì)量要高。

在精子獲能過程中，ROS 處于低水平且受控是AR發(fā)生的先決條件。有研究表明，IVF 液中添加TA可有效清除ROS，從而阻止精子發(fā)生AR。一般來說，精子質(zhì)膜內(nèi)透明質(zhì)酸酶的作用是將細胞外基質(zhì)間的透明質(zhì)酸水解，從而幫助精子穿透卵丘細胞層進入卵母細胞完成受精。TA 對精子透明質(zhì)酸酶活性具有抑制作用，便減少了TA 與透明質(zhì)酸的反應(yīng)，進而阻止多個精子穿越卵丘細胞層與卵子接觸，從而降低多精受精的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，豬IVF 液中添加5 μg/mL TA雖不能顯著阻斷多精受精，但有降低含3 個及以上原核受精卵比例的趨勢，并可顯著提高卵裂率、囊胚率，尤其可顯著提高囊胚細胞數(shù)。本研究結(jié)果提示，IVF 液中添加TA 提高豬胚胎體外發(fā)育能力的機制可能涉及2 個過程：一方面通過控制精卵結(jié)合的時間防止卵母細胞過早受精，另一方面在精卵結(jié)合后更好地誘發(fā)卵子內(nèi)Ca震蕩，從而更高效地激活卵子，但其具體機制還需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在豬卵母細胞IVF 過程中，受精液中較適宜的精子密度為5.0×10個/mL，受精液中添加5 μg/mL TA 可顯著提高豬體外生產(chǎn)胚胎的囊胚率和囊胚細胞數(shù)。