韓迎雪，高鵬，李楠，曾申明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

精液冷凍保存技術(shù)使家畜優(yōu)秀種質(zhì)資源的傳播與保存不受限制。目前，精液冷凍保存技術(shù)在驢產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛。大量研究表明，冷凍保存后的精子活力和存活率遠遠低于新鮮精子，在冷凍過程中除了受到冷休克、冰晶體的形成和滲透壓變化外，精子細胞在冷凍過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），過量的ROS 和不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，破壞精子細胞膜，使精子在冷凍保存過程中易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并產(chǎn)生過量ROS 造成其質(zhì)膜和DNA 完整性遭到破壞，易形成低溫打擊，導(dǎo)致解凍后的精子存活率低、人工授精受胎率不高，從而限制了驢精液冷凍保存技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用。在稀釋液中加入抗氧化劑能有效保護精子在冷凍保存過程受氧化損傷，保護精子并提高其活力。

維生素E 又稱-生育酚，不濃于水，也不易被酸、堿破壞，是哺乳動物中一種重要的抗氧化物質(zhì)。維生素E 能與細胞膜磷脂雙層膜結(jié)合減少膜的氧化損傷、脂質(zhì)過氧化，還可調(diào)節(jié)精子內(nèi)ROS 濃度，進而保護精子質(zhì)膜和線粒體的完整性。Bansal 等證實維生素E在冷凍牛精液中可以降低脂質(zhì)過氧化水平。羅海玲等研究發(fā)現(xiàn)在綿羊精液稀液中添加維生素E 可有效保護精子頂體，減少頂體酶的泄露，從而提高精子活力，降低冷凍對精子的損傷，提高綿羊冷凍精液質(zhì)量。鄭自華等研究發(fā)現(xiàn)在馬精液稀釋液中添加維生素E 能提高冷凍后精子活力、頂體完整率和體外存活時間。但是在驢精液稀釋液中添加維生素E 的報道還相對較少，有必要進一步研究在精液冷凍稀釋液中不同濃度維生素E 對驢精液冷凍保存效果的影響，為提高其在驢精液冷凍保存稀釋液中的廣泛應(yīng)用提供實踐參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗公驢為6 頭3～7 歲有生育能力的德州黑驢，健康無疾病，體重在400 kg 左右。種公驢在國家黑毛驢繁育中心單舍飼養(yǎng)，自由采食、飲水，并每天在遛驢場至少運動30 min。實驗?zāi)阁H為在國家黑毛驢繁育中心隨機挑選的40 頭健康成年有生育能力的空懷母驢，發(fā)情周期正常，無生殖疾病，年齡在2～5 歲。

1.2 實驗試劑 葡萄糖（G7021）、乳糖（L2643）、棉子糖（R0250）、檸檬酸鈉（C8532）、檸檬酸鉀（C3029）、HEPES 試劑（H0527）、-脯氨酸（V900338）、二甲基甲酰胺（D4551）、脫脂奶粉（LP0031）、維生素E（T3634）、FITC-PNA（L7381）均購自默克集團；青霉素（030012659）購自河北遠征藥品公司；鏈霉素（H20054140）購自深圳華藥南方制藥公司；線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1（c2006）、鈣離子熒光探針（S1060）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HBSS（H1046）、精子DNA 染色試劑盒（A8120）均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.3 精液預(yù)處理及冷凍精液的制作 用假陰道法采集公驢精液，采集到精液后立即送往實驗室進行初步鏡檢，選擇無異味、精子形態(tài)正常和活率≥80%的精液，緩慢加入精液稀釋液中，稀釋液抗凍保護劑為5% 的DMF，另外分別添加0%、1%、2%、4% 和6% 的維生素E，輕輕上下顛倒幾次使精子與稀釋液充分混合。稀釋后的精液被分裝0.5 mL 細管中，每根細管約含有2.5×10個精子，移至4℃平衡柜中平衡2 h。取出平衡后的凍精細管，放到精子程序化冷凍儀中，設(shè)置好降溫曲線，進行精液冷凍。解凍時將凍精細管至于38℃水浴鍋30 s 以上，使用計算機輔助精子活力分析分別觀察和記錄每組精子的精子總運動率（TM）、直線前進運動率（PM）、曲線運動速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線運動速度（VSL）等運動參數(shù)，至少觀察5 個視野，統(tǒng)計平均值。其中，冷凍基礎(chǔ)稀釋液A 液：16 g 脫脂奶粉溶解于200 mL 超純水中。B 液：葡萄糖10 g、乳糖0.6 g、棉子糖0.6 g、檸檬酸鈉0.12 g、檸檬酸鉀0.164 g、HEPES 2.984 g、脯氨酸0.921 04 g；滅菌超純水定容至200 mL。將制備好的A 液和B 液混合后充分混勻，在115℃高壓滅菌15 min，室溫冷卻后加入0.017 5 g青霉素和0.021 g 鏈霉素，放置于4℃冰箱保存。

1.4 畸形率 將顯微鏡放大倍數(shù)調(diào)至200×，恒溫臺溫度調(diào)至37℃，打開計算機輔助精子活力分析儀，用移液槍取7 μL 精液滴放在預(yù)熱載玻片上，蓋好載玻片，使精子均分分布。將載玻片放在連接精子活力分析儀的顯微鏡下，記錄正常精子數(shù)、畸形數(shù)，更換視野重新統(tǒng)計，每個樣品統(tǒng)計至少5 個以上視野，統(tǒng)計平均值。

1.5 質(zhì)膜完整性 采用低滲試驗檢測膜完整性和精子活力強弱。低滲濃液成分含有枸櫞酸鈉、-果糖和超純水。取出凍精細管，把其中的精液注入離心管中，在38℃水浴鍋中放置10 min，待活力恢復(fù)后檢測。觀察和記錄卷尾精子數(shù)和總精子數(shù)，每個視野精子數(shù)不少于200個，至少連續(xù)觀察5 個視野，統(tǒng)計平均值。

1.6 頂體完整性 使用花生凝集素異硫氰酸熒光素雙染色來評估頂體完整性。將DMEM 培養(yǎng)液和冷凍精液在38℃水浴鍋中預(yù)熱，取FITC-PNA 加入DMEM 培養(yǎng)液充分混勻，避光操作。將精液加入DMEM 培養(yǎng)液顛倒混勻，1500 r/min 離心4 min，棄除上清。在沉淀精子中加入工作液，避光孵育15 min，最后，1 500 r/min離心4 min，棄除上清。加入預(yù)熱的DMEM 培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻后，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清。重復(fù)上一步操作一次，最終加入洗滌液待測。用流式細胞儀檢測，X 軸通道ECG（紅光），Y 軸通道FITC（綠光），頂體完整精子的頭前部則發(fā)出明亮綠光，頂體損傷精子的頭前部發(fā)光區(qū)域不完整或不發(fā)光。

1.7 線粒體膜電位 本試驗采用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測精子線粒體膜電位，根據(jù)說明書詳細操作步驟進行操作。

1.8 DNA 完整性 本試驗用吖啶橙法檢測DNA 完整性，試劑盒為索萊寶公司提供，根據(jù)說明書詳細操作步驟進行操作。

1.9 線粒體鈣含量 采用鈣離子熒光探針檢測線粒體鈣含量，具體步驟為：將精液樣品并加入HBSS 溶液顛倒混勻，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；加入工作液，輕輕吹打，避光孵育，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；加入HBSS 溶液，輕輕吹打，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；重復(fù)上步操作一次，最終加入HBSS 溶液，調(diào)節(jié)精子密度至1×10/mL，室溫孵育待測。流式細胞儀檢測，F(xiàn)luo-4 可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光，激發(fā)波長為488 nm 左右，發(fā)射波長為512～520 nm。流式細胞儀檢測熒光強度,檢測細胞數(shù)不少于10 000 個，以平均熒光強度值表示線粒體中Ca濃度。

1.10 人工授精 人工授精試驗分為鮮精組和凍精組，分別對70 頭和40 頭母驢進行同期發(fā)情處理。試驗當(dāng)天（第0）每頭母驢注射1 mL 促性腺激素釋放激素（Gonadotrophin Releasing Hormone，GnRH）類似物；在第2 天，將陰道栓埋植在陰道穹窿內(nèi)；在第8 天，每頭母驢肌肉注射4 mL 前列腺素（Prostaglandin，PG）；在第11 天，取出陰道栓，同時每頭母驢肌肉注射4 mL PG，撤栓后第5 天內(nèi)，每天08:00—10:00 用B 超隔直腸壁檢測和記錄卵泡發(fā)育情況，當(dāng)母驢優(yōu)勢卵泡直徑>30 mm 時被視為進入發(fā)情期。當(dāng)母驢優(yōu)勢卵泡直徑達到30 mm 以上時肌肉注射GnRH 類似物1 mL，22 h 后檢查卵泡排卵情況，對已經(jīng)排卵的母驢輸入鮮精或冷凍精液4 支，每支含有約1.2 億有效精子，而沒有排卵母驢在GnRH 類似物注射后34 h 輸精4 支。輸精結(jié)束后每頭母驢注射2 mL 的縮宮素，加速子宮蠕動，促進精子運行。母驢輸精后15 d 用直腸超聲波檢查妊娠狀態(tài)，如果子宮內(nèi)出現(xiàn)胚泡，則統(tǒng)計為妊娠，否則統(tǒng)計為空懷。

1.11 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)使用SPASS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗后，用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異，當(dāng)<0.05 時，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 在稀釋液中添加不同濃度維生素E 對精子解凍后運動參數(shù)的影響 由表1 可知，當(dāng)添加1% 維生素E 時，與對照組相比精子的TM 和PM 有一定的增加（>0.05）；當(dāng)添加2% 維生素E 時，PM、TM、VCL、VAP、VSL均顯著高于其他組；當(dāng)維生素E 濃度升為4%和6%時，PM 和TM 逐漸下降，但較對照組仍有一定提高（>0.05）。

表1 稀釋液中添加不同濃度維生素E 對驢精子冷凍解凍后運動參數(shù)的影響

2.2 在稀釋液中添加不同濃度維生素E 對驢精子解凍后各功能參數(shù)的影響 由表2 可知，稀釋液中添加維生素E 可降低驢冷凍解凍后精子的畸形率，提高了冷凍解凍后的頂體完整率、DNA 完整率、線粒體膜電位和鈣離子含量，其中2%維生素E 組效果明顯，與其他組差異性顯著（<0.05）。但當(dāng)維生素E 濃度繼續(xù)增加時，畸形率開始升高，頂體完整率、DNA 完整率、線粒體膜電位、鈣離子含量則開始出現(xiàn)下降趨勢，但是與對照組相比仍有差異。在稀釋液中添加不同濃度維生素E 時對冷凍解凍后精子質(zhì)膜完整率的影響不顯著。

表2 稀釋液中添加不同濃度維生素E 對驢精子冷凍解凍后各功能參數(shù)的影響

2.3 驢冷凍精液輸精后的妊娠結(jié)果 根據(jù)以上結(jié)果，分別用鮮精和添加2% 維生素E 組冷凍精液進行人工授精試驗。鮮精組70 頭母驢經(jīng)同期發(fā)情處理后，在第12～16 天用超聲波觀察母驢卵泡發(fā)育情況。結(jié)果如表3所示，5 d 內(nèi)發(fā)情母驢頭數(shù)為60 頭，發(fā)情率為85.7%。發(fā)情母驢按照設(shè)計方案進行人工授精，共輸精60 頭，在授精后15 d 用超聲波檢查妊娠狀態(tài)，其中11 頭妊娠，妊娠率為45%。冷凍精液組40 頭母驢經(jīng)同期發(fā)情處理后，在第12～16 天用超聲波觀察母驢卵泡發(fā)育情況，結(jié)果顯示，5d 內(nèi)發(fā)情母驢頭數(shù)為32 頭，發(fā)情率為80.0%。發(fā)情母驢按照設(shè)計方案進行人工授精，共輸精32 頭，在授精后15 天用超聲波檢查妊娠狀態(tài)，其中11頭妊娠，妊娠率為34.4%。結(jié)果顯示，冷凍精液組受胎率較鮮精組相比差距不大。

表3 母驢同期發(fā)情和人工輸精結(jié)果

3 討 論

新鮮精液中富含豐富的抗氧化酶可以抵抗冷凍保存初期的氧化作用，但是隨著保存時間的延長，這些抗氧化酶會逐漸失效，因此需要額外添加抗氧化劑緩解精子的過氧化，從而提高保存效果。本研究發(fā)現(xiàn)在凍精稀釋液中添加不同濃度維生素E 能顯著提高精子解凍后活力、線粒體膜電位、頂體完整率、DNA 完整率，降低畸形率，與對照組相比差異顯著。隨著維生素E 濃度的提高，精子運動參數(shù)逐漸升高后降低，添加2%維生素E 時效果最佳，表明維生素E 的添加對驢精液冷凍保存有一定保護作用。

維生素E 主要通過抗氧化作用提高精子的冷凍保存效果。精子質(zhì)膜富含多不飽和脂肪酸，在精子冷凍過程中，精子本身和精清中產(chǎn)生的活性氧自由基被激活，與精子質(zhì)膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，使得膜上脂質(zhì)的過氧化和脂肪酸雙鍵丟失，膜完整性喪失、精子活力下降，最終導(dǎo)致精子畸形率上升，質(zhì)膜完整率和頂體完整率下降。另外ROS 含量過高會造成精子DNA 雙鏈斷裂，DNA 出現(xiàn)碎片化，DNA 完整率降低。精子對低溫比較敏感，冷凍過程中精子獲能和運動時容易發(fā)生線粒體功能障礙，從而引起線粒體膜電位和鈣離子含量的下降，供能（ATP）不足。上述精子功能指標均會影響精子質(zhì)量，最終影響受胎率。維生素E 作為多酚類化合物，其分子中含有多個活性羥基和羧基，能提供氫自由基來有效消除ROS 和羥基自由基，從而避免發(fā)生氧化反應(yīng)，有效減少精子的氧化損傷，維持精子結(jié)構(gòu)和功能完整性；另一方面維生素E 的抗氧化性可能通過清除氫、氧自由基來實現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，在冷凍稀釋液中添加 2%的維生素E 可顯著提高精子的各項運動和功能參數(shù)，表明維生素E 可能通過抑制氧自由基的形成阻止誘發(fā)膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化，從而對精子起到保護作用。另外本實驗在精液稀釋液中添加DMF 作為冷凍保護劑，DMF 是一種無色透明的液體，可作為抗凍保護劑用于精液冷凍保存。同時DMF 是一種低分子量化合物，可以更頻繁地通過精子質(zhì)膜，減少精子暴露于高滲環(huán)境的時間，從而減少氧化應(yīng)激。

本實驗中維生素E 對精子的冷凍保護效果并沒隨著添加濃度的增加而逐漸增強，濃度超過2%后，凍后精子各項檢測指標均有所下降，這可能與過量添加維生素E 會降低冷凍稀釋液的滲透性有關(guān)。當(dāng)精液滲透壓超過一定范圍，精子會出現(xiàn)脫水、腫脹等現(xiàn)象，發(fā)生不同程度的損傷，細胞膜結(jié)構(gòu)和頂體完整性等會遭到破壞，降低精液品質(zhì)。本研究中，2%維生素E 添加對冷凍精子的保護效果最佳，可能同該添加濃度下精液滲透壓最適宜相關(guān)，也說明研究精液冷凍保護劑時需要仔細考慮不同劑量對上述因素的影響。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，在德州驢精液冷凍過程中，稀釋液中添加維生素E 能有效提高冷凍解凍后的精子運動學(xué)參數(shù)，改善畸形率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位等功能參數(shù)，并且輸精后可以獲得理想的受胎率，其中維生素E 濃度2%為最佳，之后隨著維生素E 濃度的提高，效果逐漸下降，但仍高于對照組。