吳小敏，張雙翔*，朱二鵬，許厚強，趙佳福，程振濤，代興紅，陳秀華，袁超

（1.貴州省草地技術(shù)試驗推廣站，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550002）

脂肪細(xì)胞起源于胚胎中胚層，由前體脂肪細(xì)胞分化形成，過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，PPAR）、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）和激素敏感性脂肪酶（Hormone-Sensitive Lipase，HSL）是其分化與沉積中最重要的轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶基因。近年來一系列研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）在脂肪沉積中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。大部分lncRNA 由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄，具有與mRNA 相似的5帽子結(jié)構(gòu)和3polyA 尾巴，在胚胎發(fā)育、脂肪沉積和肌肉生長中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Liu 等通過lncRNA 微陣列分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA Gm15290 能促進(jìn)脂質(zhì)沉積增加，調(diào)控脂肪形成基因和等表達(dá)。過表達(dá)lncRNA AK043773 可顯著抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中脂肪細(xì)胞分化和脂滴的形成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AMP 活化蛋白激酶1（Protein Kinase，AMP Activated Alpha 1，）是影響從江香豬肉品質(zhì)的重要候選基因。根據(jù)PRKAA1 篩選的lncRNA NONSUST004358.1 在從江香豬皮下脂肪和背最長肌組織中有較高表達(dá)，提示lncRNA NONSUST004358.1可能在從江香豬脂肪沉積中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本實驗通過分離培養(yǎng)從江香豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，分析lncRNA NONSUST004358.1 在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律，構(gòu)建pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 過表達(dá)載體，分析轉(zhuǎn)染后前體脂肪細(xì)胞中PRKAA1、FAS、HSL、PPAR的表達(dá)變化，以及對前體脂肪細(xì)胞中甘油三酯和膽固醇含量的影響，探究lncRNA NONSUST004358.1 在前體脂肪細(xì)胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織來源 5日齡從江香豬背最長肌和皮下脂肪組織。

1.2 實驗材料 T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶I、I 和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Thermo Fisher 公司的產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和2×Taq PCR Master Mix 為美國AxyGen 公司產(chǎn)品；0.1% I 型膠原酶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、巴氏吸管為無錫耐斯生物科技有限公司產(chǎn)品；含0.25% EDTA 的胰蛋白酶為賽澳美細(xì)胞技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤為Sigma 公司產(chǎn)品；胎牛血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Opti-MEM 培養(yǎng)基為美國Gibco 公司產(chǎn)品；FuGENEHD Transfection Reagent 為Promega公司產(chǎn)品；細(xì)胞RNA 提取試劑盒為美國OMEGA 公司產(chǎn)品；SsoFast EvaGreen Supermix 為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；油紅O 染色試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；甘油三酯和膽固醇檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 參照屈長青等研究方法，在無菌環(huán)境下分離從江香豬背最長肌和皮下脂肪組織，剪掉血管與筋膜后剪成1～2 mm，利用0.1% 的I型膠原酶在37℃條件對其進(jìn)行消化，皮下脂肪和背最長肌組織分別消化1 h 和2 h，將消化混合液分別經(jīng)200目、400 目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，濾液在1 500 ×g 條件下離心5 min，棄上清，沉淀用DMEM/F-12（不含胎牛血清）培養(yǎng)基吹打清洗，重復(fù)3 次，最后用含10% 胎牛血清的DMEM/F-12 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，運用差速貼壁法（4 h）對肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)一步純化，皮下前體脂肪細(xì)胞在24 h 后進(jìn)行換液。在皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培生長達(dá)到抑制后，加入含10% FBS+1 μmol/L 地塞米松+5 μg/mL 胰島素+

0.5 mmol/L 3-異丁基-1 甲基黃嘌呤的脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后，換成含10% FBS+1 μg/m L胰島素的脂肪細(xì)胞分化維持培養(yǎng)基，2 d 更換培養(yǎng)液1次，直到細(xì)胞脂滴達(dá)到80%時按照油紅O 染色說明書對誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。

1.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)前期篩選的豬lncRNA NONSUST 004358.1 序列及GenBank 數(shù)據(jù)庫登錄的豬（登錄號：XM_021076521.1）、（登錄號：NM_213839.1）、（登錄號：NM_214315.3）和（登錄號：NM_214379.1）基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計lncRNA NONSUST004358.1 擴增引物與qRTPCR 引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR 引物信息

1.3.3 pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以前期構(gòu)建的T 克隆載體pMDlncRNA NONSUST004358.1 為模板，根據(jù)設(shè)計加了酶切位點的引物進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系30 μL：Taq DNA 聚合酶15 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，100 μg/μL cDNA模板1 μL，ddHO 12 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃變性4 min，94℃變性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸10 min，共30 個循環(huán)，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用DNA 膠回收試劑盒對擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，并用限制性內(nèi)切酶I 和I 對回收產(chǎn)物和pEGFP-C1 進(jìn)行雙酶切，16℃條件下經(jīng)T4 DNA 連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5，37℃培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落并進(jìn)行菌液PCR 鑒定，對PCR 鑒定為陽性的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，質(zhì)粒進(jìn)一步雙酶切鑒定，最后將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒裝樣送上海英濰捷基有限公司測序。

1.3.4 qRT-PCR 方法的建立 分別在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的0、24、36、48、60、72、96 h和120 h 時提取細(xì)胞RNA 并逆轉(zhuǎn)錄。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 轉(zhuǎn)染前體脂肪細(xì)胞，36 h 后進(jìn)行RNA 的提取并逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，利用qRT-PCR 方法檢測lncRNA NONSUST004358.1 和PRKAA1 在2 種前體脂肪細(xì)胞不同誘導(dǎo)時間中和細(xì)胞分化相關(guān)基因和的相對表達(dá)量。熒光定量PCR 體系（10 μL）：2×SsoFast EvaGreen Supermix（High ROX）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，100 μg/μL cDNA 模板1 μL，ddHO 3 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min、95℃變性30 s、56℃/60℃退火30 s、40 個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析、延伸30 s、95℃終延伸50 s，每個樣品3 個重復(fù)。

1.3.5 Western blot 檢測細(xì)胞分化相關(guān)基因蛋白的表達(dá)量將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LncRNA NONSUST004358.1 轉(zhuǎn)染48 h 的前體脂肪細(xì)胞，利用1×RIPA 細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白提取，蛋白定量后加入適量的蛋白上樣緩沖液在100 ℃條件下進(jìn)行蛋白變性，-80℃保存?zhèn)溆?。加入按比例稀釋后的PRKAA1、FAS、HSL、PPAR一抗（山羊抗兔1:1 500）4℃過夜，TBST 洗3 次，加入二抗（山羊抗兔1:2 000）37℃孵育2 h，用-actin（鼠多抗1:1 500）作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.3.6 甘油三酯和膽固醇含量的檢測 將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 轉(zhuǎn)染前體脂肪細(xì)胞6 h 后，加入配制的細(xì)胞誘導(dǎo)分化液和細(xì)胞維持液對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，待脂滴達(dá)到飽和后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，利用1×RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并離心，取上清。按照甘油三酯和膽固醇使用說明書對其進(jìn)行檢測。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 與分析qRT-PCR 數(shù)據(jù)運用2方法進(jìn)行計算分析，同時利用軟件SPSS 18.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；Western blot 灰度值運用Image Lab 軟件進(jìn)行計算，<0.01 表示差異極顯著，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪細(xì)胞的鑒定 待細(xì)胞長至85%時，利用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基對2 種細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。如圖1 所示，在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d 時細(xì)胞形態(tài)由梭形開始向橢圓形變化；誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 時橢圓形細(xì)胞數(shù)量增多，出現(xiàn)少量脂滴；誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d 后細(xì)胞脂滴趨于明顯；誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d，細(xì)胞出現(xiàn)大量脂滴。待前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后按照油紅O 染色的說明書進(jìn)行鑒定。皮下前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O 染色與肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞基本一致。

圖1 前體脂肪細(xì)胞油紅O 鑒定

2.2 lncRNA NONSUST004358.1 和PRKAA1 在前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)規(guī)律 qRT-PCR 結(jié)果顯示，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，lncRNA NONSUST004358.1在誘導(dǎo)72 h 表達(dá)量最高，其次是0、48、60 h 和108 h，24 h 表達(dá)量最低，PRKAA1 在60 h 表達(dá)量最高，其次是72、48、96 h 和36 h 表達(dá)較高，108 h 表達(dá)量最低；皮下前體脂肪細(xì)胞中，lncRNA NONSUST004358.1 在誘導(dǎo)0 h 表達(dá)量最高，其次是72 h，在36 h 表達(dá)最低，PRKAA1 在48 h 表量最高，其次是60 h，108 h 表達(dá)量最低（圖2）。兩基因在2 種前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)基本一致，在48～96 h 表達(dá)量較高。

圖2 lncRNA NONSUST004358.1 和PRKAA1 在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1的鑒定 酶切結(jié)果顯示，在1 227 bp 和4 700 bp 左右出現(xiàn)單一亮帶（圖3），將鑒定的重組質(zhì)粒送上海英濰捷基有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)未發(fā)生基因突變（圖4），表明重組質(zhì)粒pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 構(gòu)建成功。

圖3 pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 重組質(zhì)粒雙酶切

圖4 pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果圖

2.4 過表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRTPCR 研究結(jié)果如圖5 所示，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 轉(zhuǎn)染后和的相對表達(dá)量高于對照組（<0.01）；皮下前體脂肪細(xì)胞中，pEGFP-C1-lncRNA NONSUST0 04358.1 轉(zhuǎn)染后表達(dá)量高于對照組（<0.05），低于對照組（<0.01），（<0.01）和（<0.05）高于對照組。對脂肪分化相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，和表達(dá)量均高于對照組（<0.01），表達(dá)量低于對照組（<0.01）；皮下前體脂肪細(xì)胞中，和表達(dá)量均低于對照組（<0.01），表達(dá)量高于對照組（<0.01）。

圖5 pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 轉(zhuǎn)染后對脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 甘油三酯和膽固醇含量檢測 如圖6 所示，過表達(dá)lncRNA NONSUST004358.1 后，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，膽固醇含量高于對照組（<0.01），皮下前體脂肪細(xì)胞差異不顯著；在皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量差異不顯著。

圖6 甘油三酯（A）和膽固醇(B)含量檢測

3 討 論

脂肪是動物體內(nèi)重要的儲能物質(zhì)，與機體能量平衡密切相關(guān)，在畜牧動物體內(nèi)，脂肪的分布和含量影響畜產(chǎn)品的肉品質(zhì)和風(fēng)味。脂肪是由中胚層的特化細(xì)胞群分化而來，其分化是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，受到、等多種轉(zhuǎn)錄因子和PKA（Protein Kinase A System）和MAKP（Mitogen-Activated Protein Kinase）等 信號通路的調(diào)控。近年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可通過調(diào)控脂肪相關(guān)基因表達(dá)從而參與脂肪細(xì)胞的分化與形成。Chen 等研究發(fā)現(xiàn)，lnc-U90926 過表達(dá)會抑制3T3-L1 脂肪細(xì)胞的分化，抑制脂質(zhì)蓄積，降低過氧化物酶體增殖物激活受體2（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-2，PPAR2）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein，4FABP4）和脂聯(lián)素（Adiponectin，AdipoQ）的表達(dá)。Xiong 等研究發(fā)現(xiàn)，敲除lncRNA AK079912 可抑制褐色前脂肪細(xì)胞的分化，導(dǎo)致脂肪沉積的減少和脂肪代謝相關(guān)基因（脂蛋白脂肪酶：；；甘油三酸酯脂肪酶：）的下調(diào)；豬前體脂肪細(xì)胞分化過程中，干擾lncRNA 00046716的表達(dá)導(dǎo)致FASN mRNA 和蛋白表達(dá)的下降，抑制了脂肪細(xì)胞分化，與miRNA-149 結(jié)合后會影響FASN 的表達(dá)，調(diào)控豬前體脂肪細(xì)胞分化與甘油三酯在成熟脂肪細(xì)胞中的積累。

本課題組前期通過PRKAA1 篩選出了相關(guān)lncRNA NONSUST004358.1，其在從江香豬的肝臟、脂肪和背最長肌組織中具有較高表達(dá)且高于大白豬，暗示其可能參與從江香豬的脂肪代謝與沉積。本實驗分離培養(yǎng)從江香豬原代皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，利用qRT-PCR檢 測lncRNA NONSUST004358.1 和PRKAA1 在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)，分析其表達(dá)規(guī)律。qRTPCR 結(jié)果顯示，在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞分化過程中，PRKAA1 與lncRNA NONSUST004358.1 均呈先上升后下降的表達(dá)模式，這與lncRNA 00046716 在豬前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)一致，通過與從江香豬前體脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪相關(guān)的基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA NONSUST004358.1 與PPAR、FAS 和ACC等在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中具有相同的表達(dá)趨勢，暗示其可能在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用；皮下前體脂肪細(xì)胞中，NONSUST004358.1 雖在分化前期（0～36 h）與和的表達(dá)不同，但在36 h 之后卻表現(xiàn)出相同的表達(dá)規(guī)律，表明lncRNA NONSUST0043 58.1 可能在皮下前體脂肪細(xì)胞分化后期對脂肪細(xì)胞的分化具有調(diào)控作用。lncRNA NONSUST004358.1 在肌內(nèi)與皮下前體脂肪細(xì)胞分化過程中表現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律，表明其在皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中具有不同的功能。通過檢測前體脂肪細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNA NONSUST004358.1 和的表達(dá)量，分析其表達(dá)規(guī)律，為后續(xù)研究其在脂肪分化過程中的作用機制提供試驗數(shù)據(jù)。

為探究lncRNA NONSUST004358.1 在前體脂肪細(xì)胞中對脂肪分化相關(guān)基因的影響，本實驗驗通過構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1，轉(zhuǎn)染肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞，利用qRT-PCR 和Western blot 檢測脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，和的表達(dá)量均上調(diào)；皮下前體脂肪細(xì)胞中，和表達(dá)量上調(diào)，表達(dá)下調(diào)。表明肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NONSUST00 4358.1 在轉(zhuǎn)錄水平對和基因具有正向調(diào)控作用，對FAS 在皮下前體脂肪細(xì)胞中具有負(fù)調(diào)控。Western blot 結(jié)果顯示，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中，過表達(dá)lncRNA NONSUST004358.1 上調(diào)了PRKAA1、FAS 和PPAR蛋白表達(dá) 量，HSL表達(dá)下調(diào)；皮下前體脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)AS 和PPAR蛋白表達(dá)量上調(diào)，PRKAA1 和HSL 蛋白表達(dá)量下調(diào)。說明lncRNA NONSUST004358.1 在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞中對脂肪合成基因FAS 和PPAR的蛋白具有正向調(diào)控，暗示其參與脂肪細(xì)胞的分化與脂肪的形成。FAS和PPAR作為作為脂類代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其活性的高低對動物體脂沉積具有重要意義，過表達(dá)lncRNA NONSUST004358.1 均促進(jìn)肌內(nèi)與皮下前體脂肪細(xì)胞中FAS、PPARmRNA 與蛋白的表達(dá)，表明lncRNA NONSUST004358.1 是影響豬體脂沉積的重要候選基因。甘油三酯和膽固醇作為脂肪細(xì)胞的主要代謝產(chǎn)物，脂肪細(xì)胞分化程度影響甘油三酯和膽固醇含量。本實驗通過測定轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-lncRNA NONSUST004358.1 后肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞中甘油三酯和膽固醇含量發(fā)現(xiàn)，含量均上調(diào)。表明lncRNA NONSUST004358.1 在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平調(diào)控PRKAA1、FAS、PPAR和HSL 的表達(dá)，促進(jìn)豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分化與脂肪的形成。lncRNA 參與脂肪代謝的主要調(diào)控機制是直接與靶基因結(jié)合、招募轉(zhuǎn)錄物、作為輔助因子或通過與 miRNAs 競爭性結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，而lncRNA NONSUST004358.1對PRKAA1、FAS、PPAR和HSL 的具體調(diào)控機制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗中，lncRNA NONSUST004358.1 在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)均呈現(xiàn)下降、上升、再下降的表達(dá)模式，能調(diào)控脂肪沉積相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞中油三酯和膽固醇含量，研究結(jié)果為后續(xù)探究lncRNA NONSUST004358.1 在脂肪細(xì)胞分化中的作用機制提供了理論支撐。