曾雨晗，胡德寶，李新，張林林，丁向彬，郭宏，郭益文

（天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

骨骼肌衛(wèi)星細胞（MSC）是對骨骼肌起作用的細胞，也被稱為肌原干細胞，通常在骨骼肌發(fā)生損傷或產(chǎn)生疾病后被大量激活，從而維持著骨骼肌的穩(wěn)態(tài)。而MSC 的細胞周期離不開多種蛋白的參與。這些蛋白在細胞中的表達水平很大程度取決于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）介導的蛋白質(zhì)降解的調(diào)控作用。人體內(nèi)有兩大蛋白降解系統(tǒng)：溶酶體-自噬系統(tǒng)和UPS 系統(tǒng)，UPS系統(tǒng)負責體內(nèi)80%的蛋白降解。該系統(tǒng)由E1、E2、E3 3 種泛素酶及26 s 蛋白酶體組成。其中E3 泛素連接酶是將Ub 與底物蛋白連接并傳遞到26 s 蛋白酶體進行識別的關鍵一步。在牛上泛素連接酶庫倫-5（Cullin5，Cul5）位于第15 號染色體，是庫倫家族的成員之一，由780 個氨基酸組成。作為E3 連接酶復合物的核心蛋白，Cul5 參與多種細胞活動，并發(fā)揮至關重要的骨架支撐作用。Cul5 分布在多種組織細胞內(nèi)，在心肌及骨骼肌細胞中呈現(xiàn)高表達。在細胞處于增殖期且活性增高時，Cul5 被認為可發(fā)揮促進增殖的作用，并在細胞周期、細胞的成肌分化、腫瘤的發(fā)生等多種疾病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在小鼠囊胚細胞中，敲除Cul5 致使胚胎細胞缺陷。體外表達磷酸化位點突變的Cul5 可促進大鼠內(nèi)皮細胞增殖。在疾病的發(fā)生與進程中，Cul5 的敲除或過表達，參與HIV、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的調(diào)控過程。Cul5 對細胞的增殖分化有著重要的調(diào)控作用，但該基因對骨骼肌的調(diào)控作用尚不清楚，對牛骨骼肌細胞的影響研究更是少之又少。本研究采用牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外模型，模擬骨骼肌的增殖分化過程，通過敲低Cul5 的表達，探究Cul5 對牛肌衛(wèi)星細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源 實驗室預先分離并凍存的初代牛骨骼肌衛(wèi)星細胞。

1.1.2 主要試劑 高糖培養(yǎng)基；胎牛、馬血清；Lip 3000轉染試劑（Invitrogen）；蛋白質(zhì)快速裂解液、5×Tris電泳緩沖液、10×電轉緩沖液、紫外線超敏發(fā)光液A、B 液（索萊寶，北京）、20×TBS 緩沖液；Pax7 一抗（ProteinTech）；MyHC 一抗（DSHB）；Tubulin 一抗（DSHB）；Cul5 一抗（Santa Cruz Biotechnology）。

1.1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡（Leica）、實時熒光定量PCR 儀、凝膠電泳儀（Bio-Rad）、免疫印跡條帶曝光儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)參考天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室已建立的方法進行，復蘇凍存的骨骼肌衛(wèi)星細胞，用添加1%鏈霉素的增殖培養(yǎng)基（1% 青霉素+20%FBS 胎牛血清+79% 高糖血清）培養(yǎng)細胞3～4 d，觀察細胞量占培養(yǎng)皿表面積60%～70%時進行傳代實驗，將細胞傳入與實驗相對應的細胞培養(yǎng)板中，6 孔板用于蛋白提取，24 孔板用于RNA 提取，96 孔板用于EDU 實驗。用未含抗生素（20%FBS 胎牛血清+80% 高糖血清）的增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當孔板中的細胞量占培養(yǎng)皿表面積的60%～80%后，進行脂質(zhì)體瞬時轉染或更換為分化培養(yǎng)基（1%青霉素+2%HS 馬血清+79%DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染 查找Cul5 序列（來自NCBI 數(shù)據(jù)庫），設計并合成實驗組si-RNA 和對照組si-NC，待細胞量占培養(yǎng)皿表面積的70%時進行轉染。每孔吸棄200 μL（6孔細胞培養(yǎng)板）、50 μL（24 孔細胞培養(yǎng)板）、10 μL（96孔細胞培養(yǎng)板）培養(yǎng)基，將配置好的轉染液（依照Lip 3000 轉染說明書添加）加入細胞中6 h 后，更換含有抗生素的增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RNA 的提取 用無酶的磷酸緩沖液清洗細胞2 次后，加入RNA 裂解液靜置5 min，后續(xù)參照RNA 提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 蛋白的提取 用普通的磷酸緩沖液清洗細胞2 次后，加入200～250 μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液（稀釋比例為1:100），收集細胞后低溫離心10 min（12 000 r/min，4℃），吸取上清用作后續(xù)實驗或保存于-80℃冰箱。

1.2.5 EdU 細胞增殖實驗 將轉染后增殖24 h 的細胞，按EDU 試劑盒操作。在細胞水平上探尋Cul5 對MSC增殖的影響。

1.2.6 實時熒光定量PCR 檢測Cul5 的干擾效率及增殖、分化標志因子的mRNA 表達量，引物信息Cul5 上游引物：GCAGAGTGCCAAGGCATGAT，下游引物：AGGCCCGCACTGATGATATG；Pax7 上游引物：AGC CAGAGTTTCAACGGGAG，下游引物：GTCGCCAAC AGACAACACAC；Ki-67 上游引物：GAGGTGGCTCA GGTTCGTC，下游引物：AAAGGGTTGGTGGTAAGT GGC；MyHC 上游引物：CTGGAATCCGGAGGCAGA A，下游引物：TTTTCGAAGGTAGGGAGCGG；MyOG上游引物：GGCTGACAAATGCCAGACTATCC，下游引 物：TGGTCCCTTGCTTTATCTCCCT；Tublin上游引物：CAACAGCACAGCCATCCAGGA，下游引物：TCTCAGCCTCGGTGAACTCCAT。

反應試劑及體系為：cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×All-in-One ? qPCR Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。熒光定量PCR 程序：預變性：95 ℃，60 s；變性：95 ℃，10 s；退火：61 ℃，20 s；延伸：72℃，15 s；變性、退火、延伸共35 個循環(huán)；熔解曲線：95℃ 10 s；65℃，60 s；97℃，1 s；冷卻：37℃，30 s。

1.2.7 Western Blot 檢測增殖標志因子、分化標志因子的蛋白表達量。將增殖第1 天（24 h）和分化第1、2、3 天（24、48、72 h）的細胞用裂解液裂解并收集蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度按比例加入Buffer并100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。通過Western Blot技術檢測增殖標志因子Pax7 分化標志因子MyHC 蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計分析 熒光定量PCR 和Western Blot 的結果用檢驗分析（SPASS 和Image Lab）；EdU 陽性細胞率卡方檢驗分析。

2 結果

2.1 檢測肌衛(wèi)星細胞增殖及分化前后Cul5 的表達量提取牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖第1 天（24 h）及分化后3天（24、48、72 h）的RNA 和蛋白，結果可見，Cul5在mRNA 及蛋白水平上的表達量存在顯著差異（圖1），均為分化期顯著高于增殖期。

圖1 Western Blot 及qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期(GM）及分化1、2、3 d（DM1、DM2、DM3）Cul5 蛋白及mRNA 表達水平

2.2 Cul5 si-RNA 干擾的篩選 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找Cul5 序列，設計3 條si-RNA 將其命名為（si-Cul5-1、si-Cul5-2、si-Cul5-3），結果如圖2 所示?？梢?，在mRNA 水平上設計3 條si-RNA 與對照組相比均具有極顯著的干擾效果，其中si-Cul5-2的干擾效果最明顯。在蛋白水平上驗證si-Cul5-2 的干擾效果，結果也呈極顯著趨勢，所以將si-Cul5-2 用作后續(xù)實驗。

圖2 Western Blot 及qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染si-Cul5-2 后Cul5 表達量

2.3 干擾Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響 于96孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，結果如圖3 所示，干擾Cul5 后，細胞增殖EdU 陽性率與對照組相比極顯著上調(diào)。結果表明，敲低Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖有作用。

圖3 EdU 檢測干擾Cul5 后牛骨骼衛(wèi)星細胞的增殖情況

在24 孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，提取細胞中的RNA。如圖4 所示，增殖標志因子Ki-67、Pax7 均無顯著變化，提示干擾Cul5 在mRNA 水平上對細胞增殖無顯著影響。

圖4 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染si-Cul5-2后Pax7、Ki-67 表達量

在6 孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，提取細胞中的總蛋白。如圖5 所示，增殖標志因子Pax7 顯著增高（<0.05），結果表明干擾Cul5 在蛋白水平上對細胞增殖有促進作用。

圖5 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染si-Cul5-2 后Pax7、Ki-67 表達量

2.4 干擾Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響 在24孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，更換分化培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用光學顯微鏡觀察細胞肌管的形成狀態(tài)。如圖6 所示，干擾Cul5 后骨骼肌衛(wèi)星細胞的肌管數(shù)量明顯少于對照組。

圖6 干擾Cul5 后細胞在100 倍鏡下的光鏡圖

在24 孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，提取細胞中的RNA，如圖7 所示，可見分化標志因子MyHC、MyOG 均無顯著變化，提示干擾Cul5在轉錄水平上對細胞分化無顯著影響。

圖7 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染si-Cul5-2 后MyHC、MyOG 表達量

在6 孔板中培養(yǎng)細胞并轉染Cul5 的小干擾RNA，提取細胞中的總蛋白，如圖8 所示，可見分化標志因子MyHC 顯著降低，結果表明干擾Cul5 在蛋白水平上對細胞分化有抑制作用。

圖8 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染si-Cul5-2 后MyHC 蛋白表達量

3 討 論

MSC 位于肌纖維膜和細胞外基質(zhì)之間，當其受到外界刺激被激活后，將啟動衛(wèi)星細胞的一系列反應機制并成長為成熟肌纖維，在這個過程中MSC 起到修復細胞和維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。機體內(nèi)最主要降解蛋白質(zhì)的途徑是UPS 系統(tǒng)，其在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)平衡和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面的重要性不言而喻。同時UPS 在DNA 損傷和修復、細胞增殖、分化等多種細胞調(diào)節(jié)方面也有著不可忽視的作用。UPS 是多步驟反應過程，通過對泛素分子傳遞的連級反應，對底物蛋白進行泛素化標記，使其被降解。E3 連接酶則起著傳遞泛素分子和連接底物蛋白的重要作用。Cul5 作為E3 泛素連接酶的核心骨架成分，在多種細胞中都表現(xiàn)出抑制增殖的效果。研究報道，降低Cul5 的表達對小鼠肺癌細胞的增殖有調(diào)控作用，并可抑制癌細胞的遷移。Cul5 也可通過調(diào)節(jié)線粒體活性蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，影響細胞因子的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達，從而調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡和DNA 修復等生物過程。目前，前人對Cul5 的研究側重于其在癌細胞中的表達和癌癥發(fā)展，對肌肉的調(diào)控以及在牛上的實驗很少。所以本實驗以Cul5 為實驗目標，以牛骨骼肌衛(wèi)星細胞為基礎展開實驗。結果顯示，分化前后mRNA 和蛋白水平上Cul5 表達量均有顯著變化，均在分化期表達量較高，提示Cul5 可能對細胞分化有調(diào)控作用。然而，敲低Cul5 后，在mRNA 水平上，該基因對增殖及分化標志因子均無顯著影響，但在蛋白水平上卻影響顯著，即Pax7 顯著增高，MyHC 顯著下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能在于Cul5 是通過其翻譯后修飾進而表達蛋白，發(fā)揮影響細胞進程的作用。也有相關文獻說明這一觀點。在大鼠腎上腺髓內(nèi)皮細胞中VACM-1/Cul5 的抗增殖效果取決于其后翻譯修飾。本研究表明Cul5 對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化有重要的調(diào)控作用。Cul5 的功能具有組織特異性，在不同組織中發(fā)揮著不同作用。研究發(fā)現(xiàn)，Cul5 在大鼠內(nèi)皮細胞促進其增殖，但在小鼠腎小球足細胞抑制其增殖。基因功能的多變性使不同細胞發(fā)揮的調(diào)控作用不同，具體機制還待進一步研究。

4 結 論

本研究以牛肌衛(wèi)星體外成肌誘導分化模型為基礎，探尋Cul5 對MSC 的調(diào)控作用，通過研究結果可以得出：干擾Cul5 能夠促進MSC 的增殖，并抑制其分化過程，可為進一步研究Cul5 在牛肌肉發(fā)育分化中的調(diào)控機制提供一定參考。