齊 婧，譚婭，王婧，張靜，趙春萍，張正群，史開志*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005；2.貴州省地方豬保護與繁育工程研究中心，貴州貴陽 550005）

我國是畜禽肉制品消費大國，肉類消費常年穩(wěn)定在8 000 萬t 以上，主要以豬肉、禽肉、牛肉和羊肉為主。豬肉是我國第一大肉類消費品，其次是禽肉，牛羊肉占比相對較小。受非洲豬瘟疫情影響，禽牛羊肉替代效應明顯，占比明顯提升。隨著生活水平的不斷提高，人們對畜產(chǎn)品肉質的要求日益增高。生產(chǎn)優(yōu)質畜產(chǎn)品是當前分子育種的重點，肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）是指沉積在肌束間和肌細胞內(nèi)的脂肪，其含量是影響肉品質的關鍵因素。影響IMF 含量變化的相關因素包括品種、肌肉類型、性別、年齡、營養(yǎng)水平等。IMF 沉積在纖維束之間，從而分離并稀釋肌束膜膠原纖維，并破壞肌內(nèi)結締組織結構，有助于增加肉的嫩度。豬肉IMF 含量的理想范圍控制在2%～3%，人們對牛肉可接受的最低IMF 含量為3%～4%，羊肉為5%。隨著全轉錄組技術在畜牧產(chǎn)業(yè)中推廣和應用，大量非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）被鑒定為肌內(nèi)脂肪沉積的關鍵調(diào)控因子。畜禽產(chǎn)品肉質的提高需要盡可能增加IMF 含量，同時不增加內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪含量。本文就近年來ncRNAs 對肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控進行綜述，以期為日后培育優(yōu)質畜產(chǎn)品提供理論參考。

1 IMF 細胞的來源與分化

脂肪的沉積包括脂肪細胞數(shù)目的增加和細胞體積的肥大，肥胖動物較正常個體的脂肪細胞體積更大。IMF含量主要取決于肌內(nèi)脂肪細胞的大小、數(shù)量和肌肉生長速率，說明在IMF 沉積過程中肌肉細胞和脂肪細胞是相互作用的，IMF 的出現(xiàn)晚于其他脂肪儲存庫的脂肪細胞。關于IMF 細胞的確切來源未有定論，但諸多研究表明，骨骼肌血小板源性生長因子受體陽性（Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha Positive，PDGFR）細胞群可分化成充滿脂滴的纖維/ 脂肪生成祖細胞（Fibro-Adipogenic Progenitors，F(xiàn)APs），是IMF 細胞的主要來源。IMF 沉積是在細胞水平通過脂肪細胞生成實現(xiàn)的，主要包括前脂肪細胞的增殖及分化過程。前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程主要包括停滯期、擴增期、早期分化期和終末分化期4 個階段，該分化過程還受到一系列轉錄因子的調(diào)控，如過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，）、CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT Enhancer-Binding Protein，）等。

IMF 細胞分化與其他脂肪細胞存在差異。與皮下前脂肪細胞相比，肌內(nèi)前脂肪細胞中與脂肪細胞分化相關基因的初始表達相對較慢，IMF 細胞中成脂分化基因的表達活性遠低于皮下脂肪細胞，而且IMF 細胞比皮下脂肪細胞更小。Han 等為研究豬肌內(nèi)前脂肪細胞在體內(nèi)的發(fā)育情況，用肌肉條件培養(yǎng)基（Muscle Conditional Cultured Medium，MCM）對前體脂肪細胞進行細胞外微環(huán)境模擬，結果表明，胰島素信號傳導在豬脂肪細胞分化中起著重要作用，但是胰島素受體（Insulin Receptor，）和胰島素樣生長因子1 受體（Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor，）在豬肌內(nèi)前體脂肪細胞中的表達水平高于皮下前體脂肪細胞。IMF 細胞與內(nèi)臟脂肪細胞分化也存在差異。Chen 等研究發(fā)現(xiàn)，IMF 來源的脂肪細胞比內(nèi)臟脂肪來源的脂肪細胞累積更多的脂質，和在IMF 細胞中表達量更高，而且IMF 細胞的脂肪酸的從頭合成和攝取都比內(nèi)臟脂肪細胞活躍。此外，Chen 等研究發(fā)現(xiàn)豬背最長肌IMF 含量高于半腱肌；在肌內(nèi)前脂肪細胞的分化過程中，背最長肌中與脂肪細胞分化相關基因的表達量和激活脂肪生成信號均高于半腱肌，豬背最長肌比半腱肌的脂質蓄積更早，而且背最長肌的肌內(nèi)前脂肪細胞更大。

綜上所述，皮下前脂肪細胞脂質沉積高于肌內(nèi)前脂肪細胞，探究2 種細胞分化的差異能為選育高肌內(nèi)脂肪畜禽提供新思路。目前已有大量研究關于肌內(nèi)脂肪細胞與其他脂肪細胞的分化差異，但比較不同肌內(nèi)脂肪細胞分化的研究相對較少，日后可考慮加強此方面的研究。

2 ncRNAs 及其作用機制

ncRNAs 是一類表觀遺傳調(diào)控因子，在表型變異、染色質結構、轉錄、RNA 編輯、翻譯等功能中發(fā)揮重要作用，參與許多生理和病理過程。研究證據(jù)表明，在人類基因組中90% 以上的序列能被轉錄成RNA，只有2%的mRNA 被翻譯成蛋白質，其余大部分轉錄成ncRNAs。ncRNAs 包括核內(nèi)小分子RNA（Small Nuclear RNA，snRNA）、核仁小分子RNA（Small Nucleolar RNAs，snoRNA）、小RNA（MicroRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（Long Non-Coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（CircularRNA，circRNA），其中miRNA、lncRNA 和circRNA 在肌內(nèi)脂肪沉積中研究較為廣泛。

miRNA 是長度為18～24 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，由具有發(fā)夾結構的單鏈RNA 前體經(jīng)Exportin5 酶轉運出核，并經(jīng)Dicer 酶切割后生成成熟體，主要存在于細胞質中，物種間序列保守性高。miRNA 在基因轉錄后調(diào)節(jié)中起重要作用，通過靶向mRNA 的3'非編碼區(qū)（3'untranslated region，3'-UTR）的特定位點與種子序列的互補堿基配對，導致mRNA降解或翻譯抑制（圖1）。

圖1 miRNA 作用機制

lncRNA 是長度大于200 nt 的非編碼RNA，主要由RNA 聚合酶II 指導轉錄，沒有開放閱讀框或蛋白編碼潛能。lncRNA 的序列在物種間保守性低，在不同細胞、組織和發(fā)育階段具有表達特異性，lncRNA 可定位在細胞質和細胞核中。根據(jù)lncRNA 編碼序列與蛋白質基因的相對位置，可以將lncRNA 分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子lncRNA 和基因間lncRNA。lncRNA 可以調(diào)節(jié)機體的多種生命活動，包括表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控和轉錄后調(diào)控。根據(jù)現(xiàn)有研究，lncRNA 的作用機制分為以下4類（圖2）：①信號：部分lncRNA 會被特異性地轉錄，并作為信號傳導分子參與信號通路的傳導，調(diào)節(jié)下游基因的轉錄；②分子誘餌：直接與RNA 或蛋白（轉錄因子/轉錄調(diào)節(jié)子）結合，從而阻斷該分子的作用和信號通路，如競爭性內(nèi)源RNA（Competing Endogenouse RNA，ceRNA），lncRNA 能競爭性結合miRNA，作為miRNA 的“海綿”，解除miRNA 對其靶基因的抑制作用；③導向：lncRNA 與蛋白結合后，將蛋白復合物定位到特定的DNA 序列上，從而調(diào)控下游分子的轉錄，這是順式調(diào)控和反式調(diào)控的作用機制；④分子支架：lncRNA 同時結合多個效應分子，起“中心平臺”的作用。

圖2 lncRNA 作用機制[30]

circRNA 是在真核細胞中表達的內(nèi)源性共價閉合環(huán)狀非編碼 RNA，由mRNA 前體的反向剪接形成。circRNA 具有穩(wěn)定性高、高度保守的特點，表達具有種屬、組織、時間特異性。大部分circRNA 位于細胞質中，少部分內(nèi)含子來源的位于細胞核中。目前研究表明，circRNA 作用機制主要包括：①可作為miRNA 的分子海綿來調(diào)節(jié)miRNA 及其靶基因的表達；②circRNA 可以通過與RNA 結合蛋白（RNABinding Proteins，RBPs）的結合，調(diào)節(jié)基因表達和蛋白質翻譯，比如通過與轉錄因子的結合來抑制基因的轉錄；③少數(shù)circRNA 可以編碼多肽，通過該多肽發(fā)揮調(diào)控功能。circRNA 的作用機制見圖3。

圖3 circRNA 作用機制[37]

3 ncRNAs 與肌內(nèi)脂肪沉積

3.1 miRNA

3.1.1 miRNA 表達譜差異 在不同IMF 含量的肌肉組織中，miRNA 的表達譜存在差異。Li 等對高低IMF 的新疆褐牛背最長肌進行高通量測序，共有362個差異表達miRNA，其中252 個顯著上調(diào)，110 個顯著下調(diào)。Mir 等通過對夏洛萊×荷斯坦雜交F代的高IMF 和低IMF 牛背最長肌的miRNA 表達模式進行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)38 個miRNA 差異表達，其中l(wèi)et-7a-5p、miR-10b-5p、miR-100-5p、miR-101-5p、miR-105a/b、miR-135a-5p 在高IMF 中高表達，let-7e-5p、let-7f-5p、miR-877-5p 在低IMF 中高表達。Sun 等對高、低IMF 的約克夏豬進行高通量測序，排名前五的差異表達miRNA 分別是miR-365-3p、miR-208b、miR-206、miR-126-5p 和miR-10a-5p，其中，只有miR-365-3p 在低IMF 組中高表達，其他miRNA 在高IMF 組中高表達。miRNA 表達模式在肌肉不同發(fā)育期也存在差異。Fu 等評估了miRNA 在固始雞肌肉纖維生長和肌內(nèi)脂肪沉積中的表達模式，構建了6、14、22 和30 周4 個胸肌組織小RNA 文庫，共鑒定出92個差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-103-3p、miR-138 和miRNA -2-3p 可能在 IMF 沉積中起關鍵作用。

3.1.2 miRNA 對IMF 沉積的調(diào)控 在反芻動物中，miRNA-1271 在延邊公牛和閹牛的背最長肌中差異表達，Xu 等研究發(fā)現(xiàn)miR-1271 靶向轉錄激活因子3（Activating Transcription Factor 3，）的3'-UTR并下調(diào)其表達，促進和的表達，從而增加甘油三酯的累積。miR-100 通過靶向的3'-UTR 抑制其表達，并調(diào)控IGF1R/PI3K/AKT 信號通路；miR-100 增加油酸誘導的骨髓間充質干細胞肌管中的脂質沉積，促進肌內(nèi)脂肪沉積。miR-224 與肌內(nèi)脂肪沉積呈負相關，研究發(fā)現(xiàn)miR-244 負向調(diào)控脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase，），同時、CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT enhancer-Bnding Protein，）、、脂肪酸合 酶（Fatty Acid Synthase，）和脂滴包被蛋白-1（Perilipin 1，）等與脂肪生成相關基因表達下調(diào)，脂滴累積相應減少。與miR-224 相反，miR-378 通過AMPK 信號通路靶向鈣/ 鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激 酶2（Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinase 2，），部分脂肪生成基因表達上調(diào)，促進牛肌內(nèi)前脂肪細胞成脂分化。miR-193a-5p 與綿羊肌內(nèi)脂質沉積相關，它直接與乙酰輔酶A 酰基轉移酶2（Acetyl-Coenzyme A Acyltransferase，）的3'-UTR 結合抑制前脂肪細胞的增殖和分化。

在單胃動物中，miR-125a-5p 通過靶向豬Krüppel樣因子13（krüppel-like factors，）和超長鏈脂肪酸延伸長酶（Elongation of very Long Chain Fatty Acids 6，）參與調(diào)節(jié)豬肌內(nèi)脂肪細胞的增殖和分化，miR-125-5p 的過表達增強了豬肌內(nèi)前脂肪細胞的增殖但降低了分化。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p直接靶向SMAD 家族成員4（SMAD family member 4，）來減弱TGF-信號傳導，從而抑制了細胞增殖；而且，miR-146a-5p 通過靶向TNF 受體關聯(lián)因子6（TNF Receptor Associated Factor 6，）來削弱其下游的AKT/mTORC1 信號傳導，從而抑制了肌內(nèi)前脂肪細胞的分化。最近，Wang 等研究發(fā)現(xiàn)miR-34a直接靶向?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4，），并降低、固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c（Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1，）等脂肪生成基因的表達，但增加了脂肪甘油三酯脂酶（Adipose Triglyceride Lipase，）和脂肪分解基因的表達，從而抑制脂滴的累積。此外，miR-32-5p 通過抑制Krüppel 樣因子3（Kruppel-Like Factor 3，）促進脂肪細胞分化。

在家禽動物中，miR-18b-3p 可通過負向調(diào)節(jié)?；oA 硫酯酶13（acyl-CoA thioesterase 13，）抑制雞肌內(nèi)脂肪細胞分化。miR-15a 可以通過靶向乙酰輔酶A ?；D移酶2（Acetyl-Coenzyme A Acyltransferase，）、酯酰輔酶A 氧化酶1（Acyl-Coenzyme A Oxidase 1，）和甾醇載體蛋白2（Sterol Carrier Protein 2，）降低脂肪酸氧化，進而間接促進雞肌內(nèi)前脂肪細胞的分化；而且miR-15a 過表達顯著促進肌內(nèi)成脂分化，增加脂肪細胞中膽固醇和甘油三酯的積累。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p與視黃素X 受體基因（Retinoid X Receptor Gamma，）的3'-UTR 結合下調(diào)了和叉頭狀轉錄因子O1（Forkhead Box O1，）的表達水平，上調(diào)和脂肪酸結合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4，）的表達水平，促進脂肪細胞分化。miR-223 靶向線粒體甘油-3-磷酸?；D移酶（Mitochondrial Glycerol-3-Phosphate Acyltransferase，），負向調(diào)控其表達，抑制雞肌內(nèi)脂肪細胞分化。

綜上所述，miRNA 與畜禽IMF 細胞的脂質累積、增殖和分化密切相關，但缺乏對不同肌肉組織的IMF進行miRNA 表達譜及調(diào)控機制的研究，從而為不同肌肉類型IMF 沉積提供基礎資料。

3.2 lncRNA

3.2.1 lncRNA 表達譜差異 lncRNA 的表達規(guī)律在不同肉質性狀中存在差異。Muniz 等對高、低大理石花紋內(nèi)洛爾牛的背最長肌的lncRNA 進行高通量測序，鑒定出50 個lncRNA 在高大理石花紋中差異表達。Wang等對萊蕪豬高、低IMF 的背最長肌進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)17 個差異表達lncRNA（11 個上調(diào)，6 個下調(diào)）。Huang 等對IMF 有顯著差異的萊蕪豬和大白豬進行RNA-seq 測序，共有55 個lncRNA 在2 個豬種間差異表達；進一步生物信息學分析表明，lncRNA 通過靶向參與過氧化物酶體增殖因子活化受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，PPAR）和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信號轉導通路的mRNA，從而在肌內(nèi)脂肪沉積中發(fā)揮重要作用。lncRNA 表達水平在不同品種的IMF 中有顯著差異。Miao 等對金華豬和長白豬的IMF 組織進行轉錄組測序，共鑒定出4 910 個lncRNA，其中119 個差異表達；進一步生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，有6 個差異表達的lncRNA 與脂肪沉積和脂質代謝相關通路有關，表明不同品種IMF 組織的脂肪代謝存在顯著差異。肌內(nèi)前脂肪細胞分化過程中的不同階段，lncRNA 的表達規(guī)律也存在較大差異。Sun 等分離了八眉豬和大白豬的肌內(nèi)前脂肪細胞，并對肌內(nèi)前脂肪細胞分化過程中4 個階段（0、2、4、8 d）進行RNA 測序，共鑒定出1932個lncRNA；其中，與脂肪合成密切相關的lnc_000414抑制豬肌內(nèi)脂肪細胞增殖。

3.2.2 lncRNA 對IMF 沉積的調(diào)控 越來越多證據(jù)表明，lncRNA 在調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積中發(fā)揮重要作用。在豬中，lnc IMF2 過表達能促進和的表達，促進豬肌內(nèi)前脂肪細胞的增殖和分化。Sun 等通過對八眉豬和約克夏豬的肌內(nèi)脂肪細胞進行轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)lncIMF4 與脂肪形成相關，它同時位于細胞質和細胞核中；體外試驗研究表明，lnc IMF4 敲低可促進豬肌內(nèi)前脂肪細胞的增殖和分化，但抑制自噬。Wang 等對淮南豬和大白豬的背最長肌中差異表達的lncRNA 進行分析發(fā)現(xiàn)，IMFlnc1 與肌內(nèi)脂肪沉積相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)，IMFlnc1 在肌內(nèi)前脂肪細胞分化過程中表達上調(diào)。機制分析揭示 IMFlnc1 通過對miR-199-5p 的海綿作用，解除miR-199a-5p 對窖蛋白-1（Caveolin-1，-1）的表達抑制，從而促進豬肌內(nèi)前脂肪細胞的分化。在家禽中，相較于腹部脂肪組織，lncAD 在IMF 中上調(diào)幅度較大。進一步研究表明，lncAD 以順式調(diào)控方式促進其上游基因硫氧還蛋白還原酶1（Thioredoxin Reductase 1，）的表達，進而增加肌內(nèi)前脂肪細胞的脂肪形成分化并抑制細胞增殖。lnc IMFNCR在肌內(nèi)脂肪細胞分化過程中顯著上調(diào)。功能分析表明，lnc IMFNCR 能夠作為ceRNA 吸附miR-128-3p 和miR-27b-3p，阻止他們對的抑制作用，從而促進肌內(nèi)脂肪細胞的分化。

lncRNA 在IMF 沉積過程中的作用越來越重要，但其參與調(diào)控IMF 沉積的機制還有待深入。因此，后期研究可通過生物信息學等手段鑒定出更多的lncRNA，尋找其靶標，研究其在IMF 沉積中的功能和具體機制。

3.3 circRNA 在ncRNA 對肌內(nèi)脂肪沉積的研究中，circRNA 的研究報道相對較少。在反芻動物中，Zhao等使用RNA-Seq 鑒定了2 月齡和12 月齡敖漢細毛羊背最長肌中差異表達的circRNA，共鑒定出11 565個候選circRNA，其中104 個circRNA 在2 個階段中差異表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)circRNA455-miR-127、circRNA455-miR-29a、circRNA455-miR-103、circRNA4557-mir149-5p 和circRNA2440-mir-23a可能參與了IMF 沉積過程，通過雙熒光素酶報告檢測，證實circRNA4557 與miR-149-5p 存在靶標關系。Shen 等研究發(fā)現(xiàn)circINSR 在胎牛的肌內(nèi)前脂肪細胞的細胞質中高表達；功能分析表明circINSR 通過對miR-15/16的海綿作用，減輕miR-15/16 對其靶基因和乙醇胺磷酸轉移酶1（Ethanolamine Phosphor Transferase 1，）的抑制，從而促進肌內(nèi)前脂肪細胞的增殖，抑制細胞凋亡。

在單胃動物中，Li 等對驢高、低IMF 的背最長肌中的circRNA 進行表達譜分析，共鑒定出12 727個circRNA，其中有127 個差異表達；進一步的分析表明，差異表達的circRNA 可能作為miRNA 的海綿，調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪細胞的分化。李媛等采用RNA-Seq 和生物信息學鑒定萊蕪和大白豬IMF 組織中circRNA 的表達情況，發(fā)現(xiàn)181 個差異表達circRNA，其中102 個在高IMF（萊蕪豬）組織中上調(diào)，79 個下調(diào)，進一步分析發(fā)現(xiàn)circ_0002807 和circ_0009352 可能調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積。盡管最近有研究對地方豬的肌內(nèi)前脂肪細胞進行全轉錄組測序分析，但未提及與肌內(nèi)脂肪沉積相關的circRNA?？傊F(xiàn)有研究表明，circRNA 在IMF沉積中的作用機制大多是與miRNA 結合，由circRNA充當分子海綿來調(diào)節(jié)基因的表達，進而調(diào)控IMF 細胞的增殖和凋亡。但circRNA 在IMF 沉積過程中的機制尚未闡明，如缺少對不同IMF 含量中差異表達的circRNA 進行具體功能研究。

綜上所述，ncRNAs 在畜禽的IMF 中表達豐富，是IMF 沉積的重要調(diào)控元件，它通過不同的靶基因和信號通路參與調(diào)控IMF 細胞的脂質累積、增殖、分化和凋亡，進而實現(xiàn)對IMF 沉積的調(diào)控作用。表1 總結了近年來ncRNAs 在畜禽肌內(nèi)脂肪沉積中的生物學功能。

表1 ncRNAs 在肌內(nèi)脂肪沉積中的功能

4 小結與展望

目前，大量研究表明ncRNAs 在IMF 沉積過程中具有重要作用，研究者們通過系統(tǒng)的生物學方法，篩選并鑒定出大量參與調(diào)控IMF 沉積的ncRNAs，為畜禽提質生產(chǎn)提供了重要理論基礎，但是關于ncRNAs 調(diào)控IMF 沉積仍存在以下問題有待探索。第一，目前關于ncRNAs 在IMF 沉積中的功能驗證基本集中在體外細胞水平，在活體內(nèi)的試驗研究較少；針對在不同物種間保守性較強且生物學功能相似的miRNA，對于一些大型動物而言，可考慮通過慢病毒載體、基因編輯等手段在小型模式動物中進行miRNA 活體功能驗證，這對未來畜禽育種具有重要意義。第二，與miRNA 在IMF 沉積中的研究相比，lncRNA 和circRNA 的研究相對薄弱，大量與IMF 沉積相關的lncRNA 和circRNA 還未挖掘出來，而且缺乏對這些高表達和差異表達的ncRNAs 進行功能驗證。第三，缺乏不同類型lncRNA 調(diào)控IMF沉積的機制研究。相信隨著生物分子技術的發(fā)展，ncRNAs 數(shù)據(jù)庫的不斷完善以及功能驗證研究的深入，ncRNAs 調(diào)控IMF 沉積的機制將會更清晰透徹，為日后選育優(yōu)質畜產(chǎn)品提供新的育種思路。