許治祥 唐發(fā)輝 趙元莙

(重慶師范大學生命科學學院,重慶市動物生物學重點實驗室,重慶 401331)

車輪蟲作為一類外寄生游走類纖毛蟲,主要寄生于魚類、貝類,少數(shù)寄生于兩棲類和甲殼類等。當其大量感染寄生時,?？芍卖~苗或魚種大批量死亡,是水產養(yǎng)殖中重要病害生物之一[1—6]。車輪蟲種類繁多、且廣泛分布于世界各地,中國、北美、歐亞大陸、以色列、南非等地均有不同程度的報道[7,8]。早期的車輪蟲研究主要集中于形態(tài)學描述、地理分布和宿主特異性等方面[9—11]。相較其他纖毛蟲而言,車輪蟲的分子生物學工作起步較晚,特別是作為寄生類群,且淡水魚類感染車輪蟲時大多為混合感染又無法單克隆培養(yǎng)等諸多因素,在一定程度抑制了車輪蟲分子生物學研究往縱深方向發(fā)展。即使在組學已應用于諸多生物類群研究的今天,車輪蟲的分子生物學研究仍相當滯后,可用分子序列在GenBank中屈指可數(shù),且90%以上的序列集中于核糖體基因的部分序列。

當前,為了對各類動物種質資源的有效保護與利用,運用各種分子標記進行不同動物群體遺傳結構及多樣性的研究屢見不鮮,尤其在哺乳動物、鳥類、魚類、昆蟲、甲殼動物及貝類中開展工作較多[12—16]。然而對車輪蟲而言,GenBank中匱乏的分子數(shù)據(jù)導致了該類群的群體遺傳研究工作難以展開。在原生動物分類系統(tǒng)中,網(wǎng)狀車輪蟲隸屬于纖毛門、寡膜綱、緣毛亞綱、游走目、車輪蟲科、車輪蟲屬[17],是淡水車輪蟲中極為常見的種類,也是淡水養(yǎng)殖病害中的高發(fā)病原之一,其分子生物學工作的開展僅始于21世紀初,且主要利用當時Gen-Bank中僅有的4條SSU rDNA的車輪蟲分子序列聚焦于緣毛類纖毛蟲分子系統(tǒng)學的探討研究[18]。隨后的工作則主要是結合形態(tài)和分子數(shù)據(jù)進行網(wǎng)狀車輪蟲物種的分子鑒定、系統(tǒng)進化及種內分化等相關研究[19—26]。迄今為止,有關網(wǎng)狀車輪蟲的群體遺傳結構及遺傳多樣性等方面的研究資料幾近空白。因此,本工作在現(xiàn)有基礎之上,基于近年來對重慶地區(qū)不同宿主采集獲取的網(wǎng)狀車輪蟲的所有樣本,并結合當前NCBI中已有可用的相關分子數(shù)據(jù),對我國分布的網(wǎng)狀車輪蟲群體的遺傳結構,尤其是不同宿主的群體遺傳多樣性、群體分化、種群歷史動態(tài)及宿主間的傳播機制等方面進行相對深入地研究與探討,以期補充與完善網(wǎng)狀車輪蟲遺傳多樣性的內容,同時為水產養(yǎng)殖中網(wǎng)狀車輪蟲的流行病學研究提供參考性資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與數(shù)據(jù)收集

本研究所涉及的網(wǎng)狀車輪蟲SSU rDNA分子數(shù)據(jù)共計20條,其中18條樣本序列源自本實驗室于2 0 1 8—2 0 2 0年分批次采集自重慶地區(qū)的鯽(Carassius auratus)與草魚(Ctenopharyngodon idellus)鰓部,且均已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫中,具體序列登錄號詳見表1;其余可用的兩條車輪蟲SSU rDNA序列(登錄號為AY741784與MG198568)來自GenBank,其宿主分別為武漢地區(qū)的草魚(Ctenopharyngodon idellus)與西藏地區(qū)的小黃黝魚(Micropercops swinhonis)。需要說明的是,本研究涉及的分子序列涵蓋了目前GenBank中所有可利用的網(wǎng)狀車輪蟲的SSU rDNA序列,所有網(wǎng)狀車輪蟲群體樣本的具體采集相關信息詳見表1。

表1 網(wǎng)狀車輪蟲樣本信息表Tab. 1 Sample information sheet of Trichodina reticulata

為了遺傳多樣性研究及統(tǒng)計分析的便利,本研究將所有群體樣本(20份)進行了不同的分組,具體分為5組: 分別為Group A(鯽來源樣本,15份)、Group B(草魚來源樣本,4份)、Group C(各地鯉科魚類: 鯽+草魚來源樣本,19份)、Group D(重慶地區(qū)全部樣本,18份)與Group E(全部樣本,20份)。本文部分圖表、相關結果描述及討論均以此為基準。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將本研究涉及的2 0條網(wǎng)狀車輪蟲的S S U rDNA樣本序列,通過Bioedit軟件進行多重序列比對,然后采用Dna SP軟件進行單倍型基因的分析,并以適度車輪蟲Trichodina modesta(登錄號: GU 906245)為外群,采用PAUP4b10軟件進行單倍型ML系統(tǒng)樹的構建;使用TreeView軟件檢查樹型的拓撲結構,并借助Photoshop CS6軟件完成系統(tǒng)樹的繪制。

1.3 核苷酸數(shù)據(jù)的處理與分析

應用MEGA6軟件進行所有序列的多重比對,然后使用Dna SP軟件計算分析核苷酸序列的單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、遺傳分化指數(shù)、基因流和核苷酸單倍型錯配分布等數(shù)據(jù)[27];同時采用Arlequin軟件獲取Tajima’sD值和Fu’sFs值進行中性檢驗分析[28];結合Dna SP與Network兩個軟件對所有樣本進行中介網(wǎng)絡圖的構建及分析。

2 結果

2.1 單倍型組成及中介網(wǎng)絡結構分析

本研究所涉及的20個網(wǎng)狀車輪蟲樣本基因序列共有9個單倍型,其中共享單倍型4個,分別為Hap1、Hap2、Hap3和Hap7,其余5個為特有單倍型(表2)。在4個單倍型中,Hap3是最大的共享單倍型,在群體中所占比例達25%;特有單倍型占全部單倍型總數(shù)的55.56%;Hap8和Hap9單倍型分別出現(xiàn)在湖北武漢漢陽和西藏茶巴朗地區(qū)(表2),所以就目前現(xiàn)有數(shù)據(jù)來說,Hap8和Hap9暫被視為湖北武漢和西藏地區(qū)特有的單倍型。

表2 網(wǎng)狀車輪蟲單倍型分布情況表Tab. 2 Haplotype distribution table of Trichodina reticulata

單倍型中介網(wǎng)絡圖整體呈輻射狀,單倍型Hap1(重慶地區(qū): 鯽)明顯位于網(wǎng)絡中央位置而成為主體單倍型,整體網(wǎng)絡圖明顯圍繞主體單倍型Hap1向四周輻射。在中介網(wǎng)絡圖中,共享單倍型Hap7距離Hap1最遠,且其宿主為草魚,顯然與其他在重慶地區(qū)鯽獲得的單倍型不同;Hap4、Hap5、Hap8和Hap9距離Hap1較遠,Hap6、Hap2、Hap3與Hap1的距離最近。Hap5、Hap8和Hap9來自假想共同祖先單倍型MV2,且3個單倍型來自不同地區(qū)(重慶、武漢、西藏)的不同宿主,即鯽、草魚和小黃黝魚(圖1)。

圖1 基于網(wǎng)狀車輪蟲SSU rDNA的單倍型中介網(wǎng)絡圖Fig. 1 Haplotype mediated network diagram based on SSU rDNA of Trichodina reticulata

2.2 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了更好地了解網(wǎng)狀車輪蟲不同單倍型群體之間的關系,以適度車輪蟲為外群,構建單倍型ML系統(tǒng)發(fā)育樹?；贛L系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖2):整個系統(tǒng)樹聚為兩支,Hap2和Hap4單獨聚為一支,而其他所有單倍型則另聚為一大支。在大支中,Hap8和Hap9首先聚支,然后與Hap5再聚支,且該支與Hap1和Hap7形成的小支構成姐妹支;然后再與Hap2和Hap4形成的小支再行聚支 (圖2)。上述ML系統(tǒng)樹結構總體體現(xiàn)出兩大特點: 支系的形成既未按地區(qū)聚支,也未按宿主進行聚支;樹型整體聚支與中介網(wǎng)絡圖的結構極為一致,即中介網(wǎng)絡結構中,距離近的在系統(tǒng)樹中幾乎聚在一起,如Hap2和Hap4,Hap3和Hap6,Hap1和Hap7,Hap5、Hap8和Hap9。

圖2 基于網(wǎng)狀車輪蟲SSU rDNA的單倍型ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of haplotype ML based on SSU rDNA of Trichodina reticulata

2.3 遺傳多樣性及遺傳分化分析

根據(jù)表3提供的相關信息,上述5組群體均呈現(xiàn)較高的單倍型多樣性(Hd≥0.5)與較低的核苷酸多樣性(Pi＜0.005): 其中單倍型多樣性指數(shù)(Hd)最高的是Group E(全部群體),其Hd值高達為0.884,該群體包含三大地區(qū)(重慶+武漢+西藏)及三大宿主(鯽+草魚+小黃黝魚)的所有樣本,其次為Group A(鯽來源群體),其Hd值均處于0.85以上,最低的是Group B(草魚來源群體)的Hd=0.5;然而核苷酸多樣性最高的卻是Group B(Pi=0.00498),最低則是Group A(Pi=0.00199),其余群體核苷酸多樣性指數(shù)則介于二者之間(表3)。通過進一步比較兩種不同宿主(鯽與草魚)寄生網(wǎng)狀車輪蟲群體的核苷酸多樣性差異,亦明顯發(fā)現(xiàn)Group B(草魚來源群體)顯著高于Group A(鯽來源群體；圖3和表3)。

圖3 基于網(wǎng)狀車輪蟲SSU rDNA的核苷酸多樣性比較Fig. 3 Comparison of nucleotide diversity based on SSU rDNA of Trichodina reticulata

表3 網(wǎng)狀車輪蟲遺傳多樣性分析及中性檢驗Tab. 3 Genetic diversity analysis and neutral test of Trichodina reticulata

此外,本研究重點對來自不同宿主的網(wǎng)狀車輪蟲群體,即Group A(鯽來源群體)與Group B(草魚來源群體)進行了遺傳分化程度與基因流動程度的研究,具體采用遺傳分化指數(shù)(Fst)及基因流(Nm)來度量。研究結果顯示(表4),Group A與Group B群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.52716(顯著大于0.25),而二者間的基因流(Nm)則為0.45(顯著小于1)。

表4 網(wǎng)狀車輪蟲群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)與基因流(Nm)分析Tab. 4 Analysis of genetic differentiation index (Fst) and gene flow (Nm) among populations of Trichodina reticulata

2.4 遺傳多樣性中性檢驗及核苷酸錯配分析

通過對5個網(wǎng)狀車輪蟲群體遺傳多樣性的中性檢驗,其結果顯示(表3): 全部群體的Tajima’sD值均為負值,除草魚寄生群體P＜0.05(P=0.014)外,其余群體P＞0.05;而Fu’sFs值除了鯽寄生群體為負值外(Fu’sFs= -0.70585),其余均為正值。另重點對Group A(鯽來源群體)與Group B(草魚來源群體)進行比較,其中Group A的中性檢驗結果為: Tajima’sD檢驗結果表現(xiàn)為不顯著負值(Tajima’sD= -0.99097,P=0.136);Fu’sFs對Group A的中性檢測結果也為不顯著負值(Fu’sFs= -0.70585,P=0.361),與Tajima’sD檢驗結果一致。而Group B的中性檢驗結果為:Tajima’sD檢驗結果表現(xiàn)為顯著負值(Tajima’sD=-0.84903,P=0.014);Fu’sFs對Group B的中性檢測結果為不顯著正值(Fu’sFs=5.09987,P=0.986)。

同時,結合核苷酸的錯配分析(圖4): 在 5個群體中,除草魚來源的群體外,其余群體均呈3—4個鋸齒型下降的多峰曲線(圖4A,C—E);而草魚來源的群體的核苷酸錯配分布圖,呈現(xiàn)一個特殊且明顯的單峰,即一條陡峭的快速下滑線之后,形成一個顯著的單峰(圖4B)。

圖4 網(wǎng)狀車輪蟲不同群體的SSU rDNA核苷酸的錯配分布圖Fig. 4 Map of SSU rDNA nucleotide mismatch for different populations of Trichodina reticulata

3 討論

3.1 網(wǎng)狀車輪蟲的遺傳結構及多樣性

在動物遺傳多樣性研究中,中介網(wǎng)絡圖的引入及其結構分析至關重要,尤其是中介網(wǎng)絡結構中的祖先單倍型的判斷對于群體的分化意義重大,類似的研究在部分甲殼動物,如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、近親擬相手蟹(Parasesarma affine)的群體遺傳多樣性中較為多見[16,29]。本研究的中介網(wǎng)絡圖顯示(圖1),整個網(wǎng)絡結構是明顯圍繞主體單倍型Hap1(鯽來源)向四周輻射。由于與主體單倍型Hap1直接或間接相連接的單倍型數(shù)量最多,且其他單倍型與其僅保留一步或兩步突變,因此推測主體單倍型Hap1為祖先單倍型[30]。進一步結合系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),以草魚為宿主的網(wǎng)狀車輪蟲(Hap7和Hap8)支系始終巢居于以鯽為宿主的網(wǎng)狀車輪蟲支系中(圖2),由此推測,本研究涉及的三大宿主(鯽、草魚與小黃黝魚)中,寄生鯽的網(wǎng)狀車輪蟲可能屬于所有群體中分化最早的種群,同時寄生草魚的網(wǎng)狀車輪蟲在最早起源上很可能是從鯽傳播而來。此外,共享單倍型Hap7(重慶草魚來源)不僅距離祖先單倍型Hap1最遠,同時也遠離其他單倍型,包括相同宿主來源的Hap8單倍型。該研究結果在一定程度上也闡明了單倍型Hap7的網(wǎng)狀車輪蟲種群在其形態(tài)上不同于其他網(wǎng)狀車輪蟲種群的特征,即缺乏中央顆粒(中央顆粒曾被視為網(wǎng)狀車輪蟲典型形態(tài)學特征之一),故該研究也支持了先前關于網(wǎng)狀車輪蟲形態(tài)分化的研究論點[25]。另外,本研究檢測到9個單倍型,其中4個為共享單倍型,5個為特有單倍型。比較有趣的是,在所有共享單倍型中,幾乎沒有不同宿主(鯽、草魚或小黃黝魚)或地理種群(重慶、武漢或西藏)的共享,換言之,所有共享單倍型均由相同的宿主來源的種群共享?；诖?可進一步推測不同宿主的網(wǎng)狀車輪蟲群體間相對獨立,群體內基因層面的交流較少。

單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)是群體遺傳多樣性衡量的一項重要指標,遺傳多樣性是物種進化的基礎,通常與種群的生存能力、適應能力及進化能力呈正相關[31]。根據(jù) Grant和Bowen(1998)提出的標準[32],單倍型多樣性(Hd)通常以 0.5 為臨界值,核苷酸多樣性(Pi)則以 0.005 為臨界值,二者的值越大,群體的多樣性程度越高。本研究結果顯示: 所有網(wǎng)狀車輪蟲群體(5組)的Hd值均大于或等于0.5(Hd≥0.5),最高達0.884(全部群體),說明網(wǎng)狀車輪蟲整體的單倍型多樣性高;而所有群體的Pi＜0.005,最高0.00498(草魚來源群體),說明網(wǎng)狀車輪蟲整體的核苷酸多樣性較低。本研究還進一步通過比較發(fā)現(xiàn)(表3),Group A (鯽來源群體)的Hd值為0.857,顯著高于Group B (草魚來源群體)的Hd值(0.500),而鯽來源群體的核苷酸多樣性(Pi)明顯低于后者(表3和圖3),則可說明鯽來源的群體核苷酸多樣性顯著低于草魚來源群體,推測可能是由于宿主鯽的大面積人工定向選育或基因改造在一定程度上也抑制了寄生網(wǎng)狀車輪蟲群體的核苷酸多樣性。然而類似于網(wǎng)狀車輪蟲的這種高Hd與低Pi的遺傳多樣性狀況也存在于其他真菌、魚類和鳥類中,如牛肝菌(Phlebopus portentosus)、褐斑鲬(Platycephalussp.1)與家雞(Gallus domesticus)等[33—35]。

3.2 網(wǎng)狀車輪蟲的遺傳分化與歷史動態(tài)分析

遺傳分化指數(shù)(Fst)通常被用于判斷族群間遺傳分化情況。一般認為,當Fst值小于0時,說明群體間基因流交流頻繁;當Fst值介于0—0.05時,群體間遺傳分化很低;當Fst值介于0.05—0.15時,群體間存在中度程度的分化;當Fst值介于0.15—0.25時,群體間高度分化;當Fst值大于0.25時,群體間極度分化[36]。本研究中鯽來源群體(Group A)與草魚來源群體(Group B)間的Fst值達到0.52716(表4),且群體統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05)。根據(jù)上述分化標準,由于兩者間的Fst顯著大于0.25,表明兩群體間已經(jīng)達到了極度分化程度。

基因流(Nm)也是衡量群體分化的另一重要特征。研究認為,群體間Nm＜1,表示群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生分化,而Nm＞1,表示群體間Nm水平較高,群體間遺傳分化較小;當Nm＞4時,種群間的基因交流更充分,遺傳分化更小[37]。鯽來源群體(Group A)與草魚來源群體(Group B)間的Nm值僅為0.45,明顯小于1,表明這兩個不同群體由于遺傳漂變已經(jīng)發(fā)生了分化,且該分化現(xiàn)象至少在形態(tài)學的中央顆粒特征方面已有所體現(xiàn)[25,26]。

Tajima[38]認為,如果Tajima’sD與Fu’sFs值呈負值,且在統(tǒng)計學上達到顯著標準,則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化,可能預示被研究種群曾經(jīng)歷過種群擴張。Group A(鯽來源群體)的中性檢驗中,Tajima’sD檢驗結果表現(xiàn)為不顯著負值(Tajima’sD= -0.99097,P=0.136);Fu’sFs對Group A的中性檢測結果也為不顯著負值(Fu’sFs= -0.70585,P=0.361),與Tajima’sD檢驗結果一致,故兩種檢測結果在一定程度上說明了Group A歷史上存在種群擴張的可能性極小,但結合Group A的多峰錯配分析圖(圖4A),便直接否定了Group A存在歷史上種群擴張的可能性,所以綜合分析認為,Group A未發(fā)生過種群擴張。

對于Group B(草魚來源群體)的中性檢驗,Tajima’sD檢驗結果表現(xiàn)為顯著負值(Tajima’sD=-0.84903,P=0.014),此結果有力地支持Group B存在過歷史擴張的可能;但Fu’sFs對Group B的中性檢測結果為不顯著正值(Fu’sFs=5.09987,P=0.986),說明Group B未經(jīng)歷過歷史的種群擴張,該結果與Tajima’sD檢驗結果相悖。然而有研究認為,Fu’sFs檢驗對群體的近期擴張比較敏感[39],所以以此推測Group B早期歷史上經(jīng)歷過種群擴張但近期未再經(jīng)歷。結合Group B的單峰錯配分析圖(圖4B),也進一步證明了Group B經(jīng)歷過歷史的種群擴張事件。綜上,Group B存在過早期的種群擴張歷史。