王 宇,常平安*,黃飛飛

(1.重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院,中國重慶 400065;2.重慶市大數(shù)據(jù)生物智能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國重慶 400065)

含patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白(patatin-like phospholipase domain containing protein,PNPLA)在哺乳動物脂質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用,近年日益受到廣泛關(guān)注[1～3]。PNPLA蛋白家族包含9種蛋白質(zhì),分為3個亞群,其中第2亞群包括PNPLA6和PNPLA7。PNPLA6和PNPLA7通常分別被稱作神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶(neuropathy target esterase,NTE)和NTE相關(guān)酯酶(NTE-related esterase,NRE)[1]。與其他亞群PNPLA成員相比,PNPLA6和PNPLA7除了含有patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域,還具有明顯不同的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TMD)和預(yù)測的環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cyclic nucleotide binding domain,CNBD)[1,4]。

NTE是在研究有機(jī)磷酸酯引起的遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)的機(jī)理過程中被發(fā)現(xiàn)的[5]。其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白,具有磷脂酶B的活性,催化卵磷脂和溶血卵磷脂的脫?；磻?yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞磷脂代謝,是胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和軸突維持所必需的蛋白質(zhì)[6～7]。盡管人們對NTE的結(jié)構(gòu)功能與表達(dá)特性的認(rèn)識已經(jīng)比較清楚,然而有關(guān)PNPLA7的研究較少。本文就PNPLA7近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,對其酶學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)與功能等進(jìn)行全面介紹,為進(jìn)一步闡明其生理功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 PNPLA7是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的溶血磷脂酶

PNPLA7是一種在小鼠、人和大鼠等哺乳動物中進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)[8～9]。小鼠PNPLA7與PNPLA6具有較高的序列相似性和相同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(圖1):N末端是1個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)(10～32氨基酸);N端為其調(diào)節(jié)域,包含3個環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CNBD)(162～259、473～564、590～680 氨基酸);C端是其催化域,包含1個patatin結(jié)構(gòu)域(924～1 090 氨基酸)[10]。

圖1 小鼠PNPLA6和PNPLA7的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域[6,10]Fig.1 Protein domains of mouse PNPLA6 and PNPLA7[6,10]

PNPLA7的外源性和內(nèi)源性表達(dá)結(jié)果均顯示,其為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種膜整合蛋白[8～9,11～12]。PNPLA7通過N末端TMD定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,其N末端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基質(zhì)腔中,N末端的TMD鑲嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,其余大部分結(jié)構(gòu)(包括調(diào)節(jié)域和催化域)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè),其中,C-末端面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)側(cè),催化域附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)側(cè)膜上(圖2A)[12]。除了N末端的TMD對PNPLA7的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位起關(guān)鍵作用外,調(diào)節(jié)域?qū)NPLA7在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的正常分布也有一定作用,研究報道,缺失調(diào)節(jié)域的PNPLA7在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上呈點(diǎn)狀聚集狀態(tài)[12]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),PNPLA7在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)膜(mitochondria-associated membrane,MAM)均有表達(dá),并且免疫熒光檢測顯示PNPLA7部分包裹線粒體[13]。

圖2 PNPLA7與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴互作的分子模型(A)正常情況下,PNPLA7通過N末端的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)鑲嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上,調(diào)節(jié)域和催化域位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè),催化域附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)側(cè)的膜上;(B)當(dāng)細(xì)胞中cAMP水平升高時,cAMP結(jié)合CNBD3,影響調(diào)節(jié)域的結(jié)構(gòu),促使催化域結(jié)合脂滴(LD)。Fig.2 Molecular model of the interactions of PNPLA7 with the endoplasmic reticulum and lipid droplets(A)Normally,PNPLA7 is anchored on the endoplasmic reticulum(ER)through the N-terminal TMD,the regulatory and catalytic domains are exposed on the cytoplasmic face of the ER membrane,and the catalytic domain is attached to the ER cytoplasmic membrane;(B)When cAMP levels are elevated in cells,cAMP binds to CNBD3 to induce the binding of the catalytic domain with lipid droplets(LDs)through affecting the structure of the regulatory domain.

體外檢測發(fā)現(xiàn),PNPLA7具有溶血卵磷脂酶的催化活性,可以水解溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)等溶血磷脂[9]。進(jìn)一步研究證實(shí),PNPLA7在體外對多種溶血磷脂具有水解活性,并在體內(nèi)僅對LPC,特別是含有不飽和脂肪酸的LPC,具有強(qiáng)烈的催化活性,釋放出脂肪酸和甘油磷酸膽堿[12]。穩(wěn)定表達(dá)PNPLA7顯著降低細(xì)胞內(nèi)的含有不飽和脂肪酸(如C16:1、C18:1和C18:2)的LPC含量,而不改變其他溶血磷脂的水平[12]。相反,在細(xì)胞內(nèi)敲除PNPLA7,細(xì)胞內(nèi)的LPC溶血磷脂酶活性顯著降低[12]。因此,PNPLA7是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的溶血卵磷脂水解酶,催化LPC脫?；x。無論是以人工底物戊酸苯酯,還是以生理底物L(fēng)PC進(jìn)行活性測定,研究都發(fā)現(xiàn):PNPLA7的酶活性依賴其催化結(jié)構(gòu)域,而并不依賴其調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[11～12]。位于催化域patatin結(jié)構(gòu)域中的GXSXG模體的絲氨酸(serine,S)是其活性位點(diǎn)氨基酸,能與有機(jī)磷酸化合物二異丙基氟磷酸(diisopropylfluo-rophosphate,DFP)結(jié)合,抑制酶活性[8]。以戊酸苯酯為底物進(jìn)行測試,結(jié)果顯示,在底物濃度為1 mmol/L的弱堿性(pH 8.0～8.5)溶液中,PNPLA7的催化活性最強(qiáng)[9]。

2 PNPLA7的表達(dá)受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控

PNPLA7在脂肪組織、骨骼肌、心肌和脂質(zhì)代謝活躍的睪丸等組織中具有相對豐富的表達(dá)[8～11]。作為一種在脂肪組織中高表達(dá)的溶血磷脂酶,PNPLA7的表達(dá)受到營養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)。在喂食狀態(tài)下,小鼠各個組織中的PNPLA7的表達(dá)相對較低;禁食則增強(qiáng)PNPLA7在脂肪組織、心肌、骨骼肌、睪丸和肝臟等組織中的表達(dá)[9,11];饑餓后再喂食則又降低PNPLA7的表達(dá)[14]。定量PCR分析發(fā)現(xiàn),禁食調(diào)控PNPLA7的轉(zhuǎn)錄剪接,增加有活性的PNPLA7的表達(dá),降低無活性的剪接突變體的表達(dá)[11]。相對喂食正常食物的小鼠,喂食高脂肪食物的小鼠肝臟的PNPLA7表達(dá)明顯增加;并且相對正常小鼠,PNPLA7在db/db肥胖小鼠肝臟中的表達(dá)也明顯增加[14～15]。

研究報道,在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程中,PNPLA7的表達(dá)在早期明顯下降,而在中后期顯著升高;在已分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中,胰島素劑量相關(guān)性地抑制PNPLA7的表達(dá)[9,14]。另外,單不飽和脂肪酸油酸增加脂肪細(xì)胞中PNPLA7的表達(dá),飽和脂肪酸棕櫚酸則不影響PNPLA7的表達(dá)[14]。因此,無論是在動物機(jī)體上還是在脂肪細(xì)胞中,PNPLA7的表達(dá)都受營養(yǎng)狀況的調(diào)節(jié);而且,PNPLA7可能在脂肪代謝和能量穩(wěn)態(tài)維持中起一定作用。此外,PNPLA7蛋白受泛素-蛋白酶體途徑和自噬降解,并且調(diào)節(jié)域中的破壞盒(destruction box)和N-末端的TMD分別是泛素-蛋白酶體途徑和自噬降解PNPLA7所必需的結(jié)構(gòu)[16～17]。

3 PNPLA7調(diào)控肝臟脂肪代謝與脂肪肝發(fā)展進(jìn)程

PNPLA7的組織分布、催化活性、細(xì)胞定位以及表達(dá)特性等提示,它可能在脂質(zhì)代謝和能量代謝中起一定作用。在COS-7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)小鼠PNPLA7,能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的含有不飽和脂肪酸的LPC含量,而不改變其他溶血磷脂的水平[12]。此外,在肝癌細(xì)胞Huh7中表達(dá)PNPLA7明顯降低脂肪積累[18],而敲減PNPLA7的表達(dá),小鼠肝臟中的脂肪積累增加[19]。有研究報道,在敲減PNPLA7的肝細(xì)胞中回補(bǔ)表達(dá)PNPLA7及其無活性的突變體,肝細(xì)胞中的脂肪水平恢復(fù)正常[15],這表明PNPLA7調(diào)控肝臟脂肪代謝與其活性無關(guān)。分子機(jī)制研究表明,PNPLA7通過與載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)的直接相互作用(這種互作不依賴PNPLA7的催化活性),抑制ApoE經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑的降解,從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性,促進(jìn)極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的分泌,降低脂肪在肝細(xì)胞中的積累[15]。在敲減肝臟PNPLA7的小鼠中,肝臟VLDL的分泌減少,促進(jìn)脂肪在肝臟中的積累,導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生[15]。這種作用只發(fā)生在饑餓狀態(tài)下,而不發(fā)生在正常喂食和高脂肪喂食狀態(tài)下[15],進(jìn)一步表明PNPLA7在能量代謝中的調(diào)節(jié)功能受營養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)控。綜上可知,PNPLA7在肝臟中通過與ApoE互作,影響其穩(wěn)定性,并通過調(diào)節(jié)VLDL的分泌,調(diào)控脂肪在其中的積累。

肝臟PNPLA7的表達(dá)水平與血漿中脂肪和ApoE的含量呈正相關(guān)[15]。PNPLA7的表達(dá)升高可增強(qiáng)肝臟脂肪以VLDL的形式分泌到循環(huán)系統(tǒng)中,促進(jìn)外周組織對脂肪的攝取,這表明PNPLA7在肝臟和血漿脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)協(xié)調(diào)中發(fā)揮一定的作用。雖然相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在喂食高脂肪、肥胖小鼠和脂肪肝病人的肝臟中PNPLA7的表達(dá)上調(diào)[14],但是當(dāng)PNPLA7敲減后,肥胖小鼠肝臟中脂肪積累并沒有逆轉(zhuǎn)反而加劇[15]。因此,PNPLA7的表達(dá)增高可能不是肝硬化的驅(qū)動力,而更可能是削弱肝硬化的一種潛在反饋調(diào)控機(jī)制。在非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者中,PNPLA7表達(dá)較高的患者的脂肪肝病情一般較輕,并且肝臟中的PNPLA7 mRNA表達(dá)隨著脂肪肝嚴(yán)重程度的增加而逐漸降低[15]。有研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞系和組織中,PNPLA7的表達(dá)下調(diào)[20]。這提示,PNPLA7表達(dá)可能是脂肪肝的良好預(yù)后標(biāo)志物,PNPLA7表達(dá)較低的脂肪肝患者可能發(fā)展到諸如肝癌等嚴(yán)重狀態(tài)。因此,PNPLA7可能在NAFLD演變?yōu)榉蔷凭灾咀冃?nonalcoholic steatosis,NAS)的過程中發(fā)揮一定作用。

4 環(huán)核苷酸調(diào)控PNPLA7與脂滴的結(jié)合

脂滴(lipid droplet,LD)作為中性脂(脂肪和固醇酯)儲存的細(xì)胞器,是成熟脂肪細(xì)胞的顯著特征結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂滴形成的場所,脂滴外周單層磷脂的成分從高到低依次為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇[21]。此外,脂滴外周的單層磷脂膜還含有溶血乙醇胺和LPC等溶血磷脂,這些溶血磷脂含有大量的不飽和脂肪酸[22～23]。

亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn),融合綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的PNPLA7除了定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),還有極少部分附著在脂滴上[9]。我們結(jié)合亞細(xì)胞定位和細(xì)胞器蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn):獨(dú)立的C端催化域完全包裹在脂滴上并導(dǎo)致脂滴聚集,其中4個假定的疏水TMD為脂滴靶向模體(LD targeting motif),PNPLA7與脂滴的結(jié)合依賴于C端催化域;刪除N末端TMD的僅含有調(diào)節(jié)域和催化域的PNPLA7并不能結(jié)合脂滴;而刪去調(diào)節(jié)域的PNPLA7雖然可借助其N末端的TMD鑲嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,借助C端催化域與脂滴結(jié)合,但并沒有導(dǎo)致脂滴成簇聚集[12,24]。這表明,PNPLA7憑借催化域結(jié)合脂滴,調(diào)節(jié)域阻礙催化域與脂滴的結(jié)合,N末端的TMD阻止脂滴成簇聚集[24]。

PNPLA7的調(diào)節(jié)域中存在3個預(yù)測的CNBD。環(huán)核苷酸,如環(huán)腺苷酸(cAMP),可能與CNBD結(jié)合,改變調(diào)節(jié)域的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響催化域的結(jié)構(gòu)和功能。在表達(dá)PNPLA7的細(xì)胞中,加入cAMP類似物8-CPT-cAMP之后,PNPLA7與脂滴的結(jié)合明顯增加[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),缺失第1個或第2個CNBD后,增加cAMP仍然可以促進(jìn)PNPLA7與脂滴的結(jié)合;而缺失第3個CNBD(CNBD3)后,提高cAMP水平并不能促進(jìn)PNPLA7與脂滴的結(jié)合[12]。這表明,cAMP調(diào)節(jié)PNPLA7與脂滴的結(jié)合依賴第3個CNBD的存在。

相關(guān)研究分析了與PNPLA7具有高度相似序列的PNPLA6,發(fā)現(xiàn)PNPLA6的3個CNBD中只有CNBD3含有脯氨酸-精氨酸-丙氨酸-蘇氨酸(PRAT)模體,推測其極可能是cAMP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[25]。另有研究發(fā)現(xiàn),增加細(xì)胞內(nèi)的cAMP可以促進(jìn)PNPLA7與脂滴的結(jié)合,但并沒有改變其催化活性[12]。因此,cAMP很可能通過直接結(jié)合PNPLA7調(diào)節(jié)域中的CNBD3改變調(diào)節(jié)域的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響催化域的構(gòu)象,調(diào)節(jié)催化域與脂滴的相互作用,使其在特定細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴)之間發(fā)揮作用(圖 2B)。

5 展望

作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種溶血磷脂酶,PNPLA7水解溶血卵磷脂,調(diào)控磷脂代謝,然而PNPLA7介導(dǎo)的磷脂代謝的生理作用并不完全清楚。PNPLA7主要在脂肪組織、心肌、骨骼肌等脂肪代謝和能量轉(zhuǎn)換活躍的組織中高表達(dá),并且其表達(dá)受到營養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),肝臟中PNPLA7通過與ApoE互作調(diào)節(jié)ApoE經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑的降解,影響VLDL的分泌,從而調(diào)控肝臟脂肪的代謝,并且PNPLA7與ApoE的互作與其催化活性無關(guān)[15]。但是,PNPLA7與ApoE互作調(diào)控ApoE穩(wěn)定性的分子機(jī)制,以及PNPLA7的溶血磷脂酶活性在肝臟脂肪代謝中的作用,至今尚不清楚。PNPLA7對小鼠肝臟脂肪代謝的調(diào)控發(fā)生在禁食狀態(tài)。禁食狀態(tài)下,PNPLA7的表達(dá)增強(qiáng),抑制ApoE經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑的降解,促進(jìn)脂肪以VLDL的形式分泌,降低脂肪在肝細(xì)胞中的積累,維持脂肪代謝穩(wěn)態(tài)和能量平衡。那么,禁食狀態(tài)下PNPLA7在肝臟中調(diào)控脂肪代謝的作用機(jī)制是否同樣存在于其他組織或器官？這也有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

研究表明,cAMP水平調(diào)控PNPLA7與脂滴的相互作用[12]。在禁食狀態(tài)下,兒茶酚胺類激素,如去甲腎上腺素和異丙腎上腺素等,結(jié)合脂肪細(xì)胞質(zhì)膜上偶聯(lián)著鳥苷酸結(jié)合蛋白Gαs的β-腎上腺素受體,激活腺苷酸環(huán)化酶,增加cAMP水平[26]。這樣禁食不僅增強(qiáng)PNPLA7的表達(dá),而且可能通過增加cAMP,促進(jìn)PNPLA7從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到脂滴的轉(zhuǎn)位從而結(jié)合脂滴,PNPLA7水解脂滴表面的LPC,改變脂滴表面的單層磷脂膜結(jié)構(gòu),促進(jìn)脂肪分解。胰島素是負(fù)調(diào)控脂肪分解的主要激素。胰島素結(jié)合其受體,通過胰島素受體底物1和2,激活磷脂酰肌醇3激酶,增加3-磷酸肌醇,激活蛋白激酶B,蛋白激酶B通過穩(wěn)定其底物含α/β水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白15和直接磷酸化激活磷酸二酯酶3B(phosphodiesterase 3B,PDE3B),分解降低cAMP水平[26]。胰島素在脂肪細(xì)胞中不僅抑制PNPLA7的表達(dá),而且可能通過降低cAMP水平,促進(jìn)PNPLA7與脂滴的分離,抑制脂肪分解,促進(jìn)脂肪合成。因此,進(jìn)一步探究在各種營養(yǎng)狀態(tài)下,PNPLA7介導(dǎo)的溶血磷脂代謝在肝臟以外的其他組織(如脂肪和肌肉組織等)中的作用,包括調(diào)控脂肪和能量代謝等,將更加深刻地揭示PNPLA7的生理功能。在這其中,PNPLA7與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴等細(xì)胞器的相互作用及其對特定細(xì)胞器脂質(zhì)代謝的調(diào)控,無疑是在分子和亞細(xì)胞水平上更加深入地闡釋其作用機(jī)制。