饒慧華 劉艷秋 黃淑暉 周吉會 楊必成

江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，江西省出生缺陷防控重點實驗室（南昌 330006）

自然流產(chǎn)的發(fā)生率約占所有妊娠的10%～15%［1］，病因復(fù)雜，與遺傳、免疫、內(nèi)分泌、生殖器官解剖結(jié)構(gòu)、環(huán)境等因素相關(guān)，胚胎染色體異常是造成早期自然流產(chǎn)的常見因素，且與母親年齡、既往流產(chǎn)次數(shù)等臨床因素有關(guān)［2-3］。雙親之一攜帶染色體異常會造成減數(shù)分裂期間同源染色體不平等交換，導(dǎo)致配子染色體不平衡性的重排，如重復(fù)或缺失，從而造成自然流產(chǎn)［4］。盡管之前的大多數(shù)研究報告稱，女性更有可能攜帶染色體異常，但一些研究報告稱男性的比例更高［5］，也有研究認(rèn)為具有流產(chǎn)史的夫婦男女染色體異常攜帶率無差別［8］，而且對有流產(chǎn)史的夫婦何時進行外周血染色體核型分析眾說紛紜［6-7］。國際上不同國家和地區(qū)關(guān)于反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）的定義不同，主要表現(xiàn)在流產(chǎn)次數(shù)和孕周等方面。因此本研究依照《自然流產(chǎn)診治中國專家共識（2020年版）》，將在妊娠28 周之前連續(xù)發(fā)生2 次及2 次以上的胎兒丟失定義為RSA，通過對江西地區(qū)997 對（1 994 例）自然流產(chǎn)夫婦的外周血染色體進行外周血染色體核型分析，比較不同流產(chǎn)次數(shù)夫婦染色體變異的類型、發(fā)生率及其在男、女性中的分布差異，探討自然流產(chǎn)與染色體變異的關(guān)系，為臨床診療和遺傳咨詢提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月至2021年12月就診于江西省婦幼保健院習(xí)慣性流產(chǎn)門診的夫婦997 對（1 994 例），年齡21～40 歲，自然流產(chǎn)次數(shù)1～6次。根據(jù)自然流產(chǎn)次數(shù)對研究對象進行分組：流產(chǎn)1、2、3、4次及以上。納入標(biāo)準(zhǔn)：不明原因自然流產(chǎn)1次及以上夫婦；自然流產(chǎn)孕周＜28周；夫婦同時進行染色體核型分析者；排除標(biāo)準(zhǔn)：因免疫、生殖解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌等因素引起的自然流產(chǎn)；人工流產(chǎn)者；夫妻一方未行染色體檢查者。所有受檢者表型和智力均正常，非近親婚配，均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 G顯帶染色體核型分析抽取夫婦雙方靜脈血3～5 mL，接種0.3～0.5 mL 至1640 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h；收獲前4 h 加入秋水仙素，使終濃度為0.08 μg/mL；細(xì)胞收獲：加入0.4%氯化鉀，37 ℃水浴30 min，立即加入固定液（冰醋酸：乙醇=1∶3）0.4 mL進行預(yù)固定，2 000 rpm離心10 min，棄上清液，再加入固定液6～7 mL，吹打混勻，固定10 min，2 000 rpm離心10 min，棄上清液；重復(fù)上述步驟；滴片、胰酶消化、吉姆薩染色，采用徠卡GSL-120 全自動染色體掃描系統(tǒng)進行掃片；核型分析：計數(shù)20個細(xì)胞，分析5 個核型，若發(fā)現(xiàn)性染色體嵌合體則增大計數(shù)量至50個，計算嵌合比例；按照《人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系》（ISCN 2020）對染色體核型進行命名。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件，組間率與構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗，流產(chǎn)次數(shù)與染色體畸變率的關(guān)聯(lián)性分析采用logistic 回歸，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 997 對自然流產(chǎn)夫婦染色體變異檢出總體分布和比例997 對自然流產(chǎn)夫婦中共檢出染色體多態(tài)83 例；染色體畸變56 例，其中染色體數(shù)目異常6 例，包括2 例性染色體嵌合體，2 例47，XXX 和2 例47，XY，+mar；染色體結(jié)構(gòu)異常50 例，包括平衡易位31 例，羅伯遜易位11 例，倒位5 例，其他染色體結(jié)構(gòu)異常3 例。RSA 夫婦中染色體變異檢出率為16.05%（83/517），流產(chǎn)1 次夫婦中染色體變異檢出率為11.67%（56/480），兩組的染色體變異類型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.43，P=0.003）。見表1。

表1 517 對RSA 夫婦異常染色體核型Tab.1 Abnormal karyotypes of 517 RSA couples

2.2 染色體異常在男、女性中的分布情況流產(chǎn)1 次夫婦中男性與女性染色體變異類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.49，P＞0.05）。在RSA 夫婦中，女性多態(tài)攜帶率為3.48%（18/517），染色體畸變率為5.03%（26/517），男性多態(tài)攜帶率為4.84%（25/517），畸變率為2.71%（14/517），男、女性染色體變異類型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.29，P=0.018）。見表2。

表2 997 對自然流產(chǎn)夫婦染色體變異核型Tab.2 Chromosomal variation karyotype in 997 couples with spontaneous abortion例

2.3 染色體異常檢出情況與流產(chǎn)次數(shù)比較不同流產(chǎn)次數(shù)夫婦染色體變異類型不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.77，P=0.001）；其中，流產(chǎn)1 次、2 次、3 次組之間染色體多態(tài)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而流產(chǎn)≥4 次組染色體多態(tài)性與其他組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；流產(chǎn)次數(shù)與染色體數(shù)目異常之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；流產(chǎn)2 次和流產(chǎn)3 次夫婦相比，染色體結(jié)構(gòu)異常差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而該兩組與流產(chǎn)1 次夫婦相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.64，P=0.002；χ2=15.48，P＜0.001）。見表3。自然流產(chǎn)3次以內(nèi)，隨著自然流產(chǎn)次數(shù)增加，染色體畸變率增加，自然流產(chǎn)次數(shù)與染色體畸變率的關(guān)聯(lián)存在著統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.648，95%CI：1.163～2.334，P＜0.05）。見圖1。

圖1 自然流產(chǎn)次數(shù)與染色體畸變率的關(guān)系Fig.1 The relationship between the number of spontaneous abortion and chromosome aberration rate

表3 自然流產(chǎn)次數(shù)與染色體變異之間的關(guān)系Tab.3 The relationship between frequency of spontaneous abortion and chromosomal variation例

3 討論

3.1 染色體結(jié)構(gòu)異常與自然流產(chǎn)本研究在自然流產(chǎn)史夫婦中共檢出染色體畸變56 例，主要是染色體結(jié)構(gòu)異常，其中染色體平衡易位占比最高（55.36%），其次為羅伯遜易位（19.64%），與王瑾等［6］的研究一致。染色體易位指兩條或兩條以上的染色體發(fā)生斷裂后，斷片之間相互交換位置而形成不同的衍生染色體，由于攜帶者并無遺傳物質(zhì)的增減，故表型和智力一般正常，但平衡易位攜帶者在與正常人婚配后理論上只有1/18 的概率生育正常人，1/18 的概率為易位攜帶者，其余均為部分單體或部分三體，通常不能正常發(fā)育而發(fā)生流產(chǎn)或停育［8］。涉及3 條染色體的復(fù)雜平衡易位攜帶者在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中至少產(chǎn)生32 種配子，

僅有一個正常配子和一個平衡易位配子，其余均為不平衡的配子［9］。但也有學(xué)者認(rèn)為實際臨床中產(chǎn)生正常和易位型的配子概率遠高于前述的理論幾率［10］，本研究就發(fā)現(xiàn)一例復(fù)雜平衡易位的女性，核型為46，XX，t（10；12；22）（q22；q13；q12），曾生育一胎表型正常的女孩，之后因自然流產(chǎn)3 次就診。羅伯遜易位為相互易位的另一種形式，指兩條近端著絲粒染色體在著絲粒處或其附近斷裂后，著絲粒融合形成兩條衍生染色體，非同源羅伯遜易位攜帶者形成正常配子的概率為1/6，同源羅伯遜易位攜帶者產(chǎn)生的配子類型均為不平衡配子，不能生育正常的后代［6］。因此在臨床咨詢時，應(yīng)根據(jù)不同的染色體結(jié)構(gòu)異常給予針對性的遺傳咨詢方案，必要時進行胚胎植入前產(chǎn)前診斷。

3.2 染色體多態(tài)與自然流產(chǎn)染色體多態(tài)性指染色體異染色質(zhì)區(qū)DNA 數(shù)量或位置的改變，一般發(fā)生在1、9、16、Y 染色體的著絲粒區(qū)和近端著絲粒染色體的短臂［11］。HERNANDEZ-NIETO 等［11］研究認(rèn)為雙親之一攜帶染色體多態(tài)并不會增加輔助生殖人群胚胎染色體非整倍體的風(fēng)險。這與ANTON等［12］的研究結(jié)果相反，不少學(xué)者均認(rèn)為染色體多態(tài)性會干擾同源染色體配對，造成減數(shù)分裂期間染色體分離錯誤，與不孕不育和早期流產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史相關(guān)，對輔助生殖有不利影響［13］。本研究共檢出染色體多態(tài)83 例，流產(chǎn)1 次、2 次、3 次之間染色體多態(tài)性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但流產(chǎn)≥4 次組染色體多態(tài)性檢出率（28.57%）明顯高于其他組，其中男性染色體多態(tài)的檢出率高于女性，可能是因為男性存在獨有的Y 染色體，剔除Y 染色體多態(tài)后兩性之間染色體多態(tài)檢出率差別并無統(tǒng)計學(xué)意義，這與趙冰清等［7］的研究結(jié)果一致。WANG 等［13］認(rèn)為Y 染色體多態(tài)性是RSA 的獨立危險因素，Yqh 的增加或減少使Y 染色體不穩(wěn)定增加，影響常染色質(zhì)基因的表達，導(dǎo)致精子生成異常，配偶易出現(xiàn)流產(chǎn)、停育等不良妊娠結(jié)局。另外，Yqh-極易合并AZF 基因微缺失現(xiàn)象，引起不同程度的精子質(zhì)量異常［14］。因此臨床上對于Y 染色體多態(tài)應(yīng)同時進行Y 染色體微缺失位點檢測，科學(xué)指導(dǎo)妊娠。另外9 號染色體臂間倒位inv（9）在國內(nèi)普通群體中的發(fā)病率為0.8%，被認(rèn)為是一種多態(tài)性，關(guān)于其是否與生殖異常相關(guān)國內(nèi)外學(xué)者眾說紛紜，本研究中流產(chǎn)≥4 次夫婦中雖然inv（9）的發(fā)生率為50%（3/6），由于病例數(shù)量太少，不足以說明inv（9）對自然流產(chǎn)的遺傳效應(yīng)，可下一步擴大樣本量做進一步的研究。

3.3 染色體異常與自然流產(chǎn)次數(shù)本研究發(fā)現(xiàn)親代染色體異常與自然流產(chǎn)次數(shù)存在相關(guān)性，自然流產(chǎn)3 次以內(nèi)，隨著自然流產(chǎn)次數(shù)增加，染色體畸變率增加，這與趙冰清等［7］的研究結(jié)果不全一致，后者雖然認(rèn)為流產(chǎn)次數(shù)與男女性染色體畸變率存在趨勢差異，但流產(chǎn)3 次、4 次及4 次以上人群的染色體畸變率均無差異，而本研究中流產(chǎn)≥4 次組的染色體畸變率為0，這可能與本研究的樣本量不足、受試人群不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)2 次和流產(chǎn)3 次夫婦之間染色體變異類型構(gòu)成比并無差別，但兩組的染色體畸變率均高于流產(chǎn)1 次夫婦。因此本研究仍支持羅英等［15］將連續(xù)發(fā)生2 次自然流產(chǎn)就應(yīng)歸于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的結(jié)論。

3.4 男女性同時檢測染色體的必要性PARK等［7］對1.9 萬例RSA 夫婦進行染色體分析發(fā)現(xiàn)女性染色體異常攜帶率顯著高于男性，其中平衡易位和羅伯遜易位男女?dāng)y帶比例分別為1∶1.38 和1∶1.30。王瑾等［6］的研究顯示自然流產(chǎn)夫婦中男女性染色體異常比為0.97∶1，認(rèn)為兩者染色體異常攜帶率并無差別。本研究發(fā)現(xiàn)在流產(chǎn)1 次夫婦中男女染色體變異類型并無差別，但在RSA 夫婦男女性染色體異常類型有差異，主要體現(xiàn)在染色體畸變率女性攜帶率高于男性，男性染色體多態(tài)發(fā)生率高于女性，這與PARK 等［5］的研究一致。本研究中攜帶羅伯遜易位的RSA 患者均為女性，這可能與羅伯遜易位男性攜帶者的細(xì)胞大部分不能進入第二次減數(shù)分裂而發(fā)生凋亡，導(dǎo)致無精或少弱精子癥有關(guān)［16-18］。胡一珍等［18］對47 例男性易位攜帶者進行細(xì)胞遺傳學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)64.10%（25/39）的染色體易位攜帶男性存在不育（無精、少弱精子癥）?？紤]到男性Y 染色體多態(tài)可能對生殖存在不利影響［12］，因此建議臨床上對RSA 夫婦應(yīng)雙方都常規(guī)行外周血染色體檢查。

綜上所述，染色體異常與自然流產(chǎn)存在明顯相關(guān)性。對于自然流產(chǎn)2 次及以上的夫婦應(yīng)常規(guī)進行染色體檢查，明確病因，指導(dǎo)遺傳咨詢和確定臨床診療方案。對于并無染色體畸變的RSA 患者應(yīng)重視其染色體多態(tài)性的遺傳效應(yīng)，評估再生育風(fēng)險，必要時給予輔助生殖。