黃江偉 江鑫 蔣長榮 龔慧琴 齊明旭

南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2急診科（湖南衡陽 421002）

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是最常見的心律失常之一，會導(dǎo)致患者發(fā)生血栓栓塞事件和心力衰竭的風(fēng)險增加［1］。心房心肌纖維化是發(fā)生在AF 心臟重構(gòu)中的特征性表現(xiàn)［2］。因此，闡明心房纖維化的潛在機(jī)制可能對AF 的臨床管理有幫助。炎性細(xì)胞在心房纖維化過程中起重要作用。在此過程中，活化的巨噬細(xì)胞可以通過傳遞趨化因子和促炎細(xì)胞因子與心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞進(jìn)行交流，從而促進(jìn)心房纖維化的發(fā)展［3］。外泌體（exosomes，Exo）是內(nèi)吞來源的微小膜結(jié)合囊泡（30～100 nm），來源于多泡體的腔膜，并可以在病理和正常條件下通過傳遞mRNA、蛋白質(zhì)和微小RNA（microRNA，miRNA）介導(dǎo)器官、組織和細(xì)胞水平的微通信［4］。最近研究表明，外泌體與AF 相關(guān)，為AF 的預(yù)防、診斷和治療帶來了新的視角［5-6］。miRNA 是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性RNA，大量存在于外泌體中［7］。其中，miR-130 是一種廣泛參與調(diào)節(jié)各種生理和病理過程的miRNA。已經(jīng)表明miR-130 可以促進(jìn)心肌肥大，并且敲低心肌細(xì)胞中miR-130 可減輕梗死誘導(dǎo)的心肌損傷［8-9］。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）處理的心肌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移外泌體調(diào)節(jié)M1 巨噬細(xì)胞極化［10］?；诖耍狙芯刻接懥薃ngⅡ?qū)π姆考〖?xì)胞外泌體中miR-130水平的影響，以及心房肌細(xì)胞外泌體是否是將miR-130 遞送至巨噬細(xì)胞的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 小鼠心房肌細(xì)胞的分離鑒定參照文獻(xiàn)方法［11］分離心房肌細(xì)胞。具體操作為：獲取48 只新生C57BL/6 小鼠心臟，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS 清洗3 次，去除血跡。將心臟切成小塊（1 mm×1 mm× 1 mm），并在含有2 g/L Ⅱ型膠原酶和2.5 g/L 胰蛋白酶的消化緩沖液中于37 ℃消化20 min，然后用吸管輕輕分散。將細(xì)胞懸液通過200 目銅網(wǎng)過濾，在室溫下以110 ×g離心5 min。通過成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的不同壁黏附持續(xù)時間實現(xiàn)小鼠心房肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS；美國Gibco 公司）和青霉素-鏈霉素（100 IU/mL）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM；美國Gibco 公司）中培養(yǎng)。對于心房肌細(xì)胞的處理，用AngⅡ（1 μmol/L）或等體積的PBS 作為對照處理細(xì)胞48 h。

1.2 外泌體分離鑒定從用PBS 或AngⅡ處理的小鼠心房肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中收集外泌體。首先，將上清液以2 000×g離心20 min 以去除細(xì)胞碎片。然后，將上清液以10 000 ×g離心30 min。接下來，將上清液再次以100 000×g離心70 min。所有離心工作均在4 ℃下進(jìn)行。離心后，收集最終沉淀物，隨后將外泌體重新懸浮在0.01 mol/L PBS溶液中。外泌體在50 μL 放射免疫沉淀分析緩沖液（上海Beyotime公司）中裂解。通過蛋白質(zhì)印跡分析外泌體陽性標(biāo)志物，包括CD63（60 KD）、Hsp70（70 KD）和TSG101（46 KD），和陰性標(biāo)志物Calnexin（90 KD）的表達(dá)。同時，分別使用HT7800透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）和NanoSight NS300納米粒子跟蹤分析（NTA，上海Malvern Instruments公司）測量外泌體的形態(tài)和直徑。外泌體在4 ℃下用2.5%戊二醛固定過夜。第二天，將外泌體加載到碳支持膜涂層網(wǎng)格上，并用磷鎢酸水溶液染色1 min。最后，使用80 kV的TEM分析外泌體的形態(tài)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以分析CD163 陽性巨噬細(xì)胞和CD86 陽性巨噬細(xì)胞的百分比。將巨噬細(xì)胞重懸于PBS 中，然后與5 μL FITC 標(biāo)記的抗CD86（美國Becton Dickinson 公司）或5 μL PE 標(biāo)記的抗CD163（Becton Dickinson）在室溫下孵育30 min。最后，使用BD AccuriTMC6 流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）分析陽性細(xì)胞。

1.4 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1 獲自中國科學(xué)院昆明動物研究所。所有細(xì)胞均在完全培養(yǎng)基中于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于THP-1 的誘導(dǎo)，從用PBS 或AngⅡ處理的心房肌細(xì)胞中獲得外泌體。然后，將THP-1 細(xì)胞與80 μg/mL 外泌體一起孵育24 h，以誘導(dǎo)M1 或M2 巨噬細(xì)胞極化。接下來，使用流式細(xì)胞術(shù)法和qRT-PCR 法測量巨噬細(xì)胞的極化。

1.5 qRT-PCR 檢測使用miRCURYTMRNA 分離試劑盒（丹麥Exiqon公司）從外泌體中分離總RNA，并使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）從細(xì)胞中分離總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（大連Takara 公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在PRISM 7500實時PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)經(jīng)典的2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達(dá)水平，U6 作為miR-130 的內(nèi)部參考。mRNA 的相對表達(dá)水平采用GAPDH 為內(nèi)部參考。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-130 shRNA 的慢病毒（sh-miR-130）及對照（sh-Ctrl）購自上海GenePharma 公司，用于抑制miR-130 在小鼠心房肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞衍生的外泌體中的表達(dá)。使用LipofectamineTM2000 試劑（美國Invitrogen 公司）將shmiR-130 和sh-Ctrl 轉(zhuǎn)染到心房肌細(xì)胞中。

1.7 動物和分組處理雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～22 g，6～8 周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。動物被關(guān)在籠子里，室溫為26 ℃，光照/黑暗循環(huán)12 h。給小鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)食物制劑并隨意提供水。將小鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組（Sham）、橫向主動脈弓縮窄術(shù)（transverseaortic constriction，TAC）組、TAC+sh-miR-130 組和TAC+sh-Ctrl 組。對TAC+sh-miR-130 組 和TAC+sh-Ctrl 組 小鼠施用攜帶sh-miR-130、sh-Ctrl 慢病毒載體。在手術(shù)前通過尾靜脈注射將病毒載體以75 μL（3.5 ×1011 GC/mL）的終體積一次性遞送給小鼠。7 d 后，所有雄性小鼠按照分組及標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行TAC 或假手術(shù)［12］。手術(shù)后3 周處死所有動物，收集它們的心臟并準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)一步的組織學(xué)分析。

1.8 超聲心動圖在TAC 或假手術(shù)后3 周，使用配備30 MHz 中心頻率運行的實時顯微可視化掃描探頭的Vevo 2100系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司）進(jìn)行超聲心動圖檢查。用異氟醚（1%）麻醉小鼠。計算左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（shortening fraction，F(xiàn)S），以此反應(yīng)左心室收縮/舒張功能。

1.9 組織病理學(xué)小鼠心臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度為5 μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（H＆E）染色（北京Biosharp 公司）以觀察心臟的病理變化。Masson 三色染色（北京Solarbio 公司）用于檢查左心室組織中膠原沉積的變化。從每個切片中選擇隨機(jī)視野并在光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）下觀察。通過Image-Pro Plus 軟件獲取和分析每個切片的一張圖像。

1.10 免疫熒光染色將每只大鼠的三個心房切片與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）（1∶500；武漢賽維爾生物科技有限公司）或CD163（1/500；英國Abcam 公司）和CD68（1∶3 000；武漢賽維爾生物科技有限公司）在4 ℃下孵育過夜。隨后，與熒光素（FITC/CY3）綴合的二抗在室溫下避光孵育1 h。將載玻片用PBS 清洗3 次，在4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；1∶1；武漢賽維爾生物科技有限公司）中孵育，然后干燥并蓋上蓋玻片進(jìn)行評估。用Eclipse C1 熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）捕獲了5 個隨機(jī)非重疊區(qū)域的熒光信號。所有圖像均通過Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。進(jìn)行Studentt檢驗以分析兩個獨立組之間的數(shù)據(jù)，單向方差分析和Tukey 事后檢驗以檢驗多組之間的數(shù)據(jù)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 心房肌細(xì)胞衍生的外泌體的表征在光學(xué)顯微鏡下觀察分離的心房肌細(xì)胞（圖1A）。為了鑒定，小鼠心房肌細(xì)胞用抗α-肌節(jié)肌動蛋白（α-SCA）染色（圖1B）。外泌體來源于PBS 或AngⅡ處理的小鼠原發(fā)性心房肌細(xì)胞，分別稱為PBS-Exo 和AngⅡ-Exo。在TEM 下，PBS-Exo 和AngⅡ-Exo 均表現(xiàn)出球形形態(tài)，直徑分布在30～150 nm 之間，具有細(xì)胞膜狀結(jié)構(gòu)（圖2A-B）。與細(xì)胞相比，PBS-Exo和AngⅡ-Exo 對外泌體標(biāo)志物CD63、HSP70 和TSG101 呈陽性，而對Calnexin 呈陰性（圖2C）。這些數(shù)據(jù)證實，外泌體有效地從PBS 或AngⅡ處理的心房肌細(xì)胞中分離出來。

圖1 小鼠心房肌細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of mouse atrial myocytes

圖2 外泌體鑒定Fig.2 Exosome identification

2.2 AngⅡ-Exo 促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化將PBSExo 和AngⅡ-Exo 與THP-1 細(xì)胞一起孵育。與PBSExo 組相比，AngⅡ-Exo 可以顯著增加巨噬細(xì)胞中iNOS 和TNF-α mRNA 的表達(dá)（P＜0.05），并降低了巨噬細(xì)胞中Arg-1 和IL-10 mRNA 的表達(dá)（P＜0.05，圖3A）。CD86 和CD163 分別是M1 巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物。與PBS-Exo組相比，AngⅡ-Exo促進(jìn)了M1 巨噬細(xì)胞極化并限制了M2 巨噬細(xì)胞極化（P＜0.05，圖3B）。

圖3 AngⅡ-Exo 促進(jìn)了M1 巨噬細(xì)胞極化Fig.3 AngⅡ-Exo promotes M1 macrophage polarization

2.3 AngⅡ-Exo 通過轉(zhuǎn)移miR-130 促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化miR-130 的表達(dá)水平在AngⅡ-Exo（圖4A）以及AngⅡ-Exo 處理的巨噬細(xì)胞中上調(diào)（P＜0.05，圖4B）。心房肌細(xì)胞、sh-miR-130-Exo和THP-1細(xì)胞中miR-130 的表達(dá)水平被sh-miR-130 處理下調(diào)（P＜0.05，圖4C）。此外，使用PKH67 來標(biāo)記shmiR-130 處理的心房肌細(xì)胞衍生的外泌體，并發(fā)現(xiàn)這些外泌體可以被THP-1 細(xì)胞有效吞噬（圖4D）。降低AngⅡ-Exo 中miR-130 的表達(dá)可以抑制iNOS和TNF-α 的表達(dá)（P＜0.05），同時促進(jìn)Arg-1 和IL-10 的表達(dá)（P＜0.05，圖4E）。此外，miR-130 的敲低下調(diào)了M1 巨噬細(xì)胞的百分比（P＜0.05），但上調(diào)了M2 巨噬細(xì)胞的百分比（P＜0.05，圖4F）。

圖4 AngⅡ-Exo 通過轉(zhuǎn)移miR-130 促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化Fig.4 AngⅡ-Exo promotes M1 macrophage polarization by transferring miR-130

2.4 miR-130 參與體內(nèi)心臟纖維化和巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)在有或沒有sh-Ctrl 對照處理的TAC 小鼠中miR-130 的水平顯著升高，并且在TAC 小鼠中在注射sh-miR-130 后顯著降低（P＜0.05，圖5A）。與TAC組相比，TAC+sh-miR-130組小鼠的EF、FS顯著提高（P＜0.05），并且HW/BW 和HW/TL 比率顯著降低（P＜0.05，圖5B-F）。TAC 小鼠心臟中的心肌紊亂且尺寸變大。相比之下，sh-miR-130 明顯改善了TAC小鼠心臟的結(jié)構(gòu)并減小了心肌的大小、纖維化水平（P＜0.05，圖5G）。此外，與假手術(shù)組相比，TAC 組小鼠左心房組織的iNOS+/CD68+巨噬細(xì)胞增加（P＜0.05）。TAC+sh-miR-130 組小鼠左心房組織的iNOS+/CD68+巨噬細(xì)胞較TAC 組顯著降低（P＜0.05），并且CD163+/CD68+巨噬細(xì)胞顯著增加（P＜0.05，圖5H-I）。

圖5 miR-130 在體內(nèi)心臟纖維化和巨噬細(xì)胞極化中的作用Fig.5 The role of miR-130 in cardiac fibrosis and macrophage polarization in vivo

3 討論

AF 是一種日益普遍的醫(yī)療保健問題，會產(chǎn)生許多危害，主要是不良的心血管和腦血管事件［1］。因此，探索AF 的發(fā)病機(jī)制，尋找治療AF 的新靶點非常必要。AngⅡ通過誘導(dǎo)心房纖維化和心房重塑參與AF的發(fā)病機(jī)制［13］。在本研究中，與PBS處理的心房肌細(xì)胞相比，AngⅡ處理的心房肌細(xì)胞分泌的外泌體中miR-130 的表達(dá)更高，其被遞送到受體巨噬細(xì)胞中以減少M2 型細(xì)胞因子（Arg-1 和IL-10）的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明源自心房肌細(xì)胞的外泌體miR-130 抑制M2 巨噬細(xì)胞極化。之前的一項研究報告稱，miR-130 促進(jìn)M1 極化并抑制M2 極化，從而調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展，本研究結(jié)果與其一致［14］。

越來越多的證據(jù)表明，外泌體是不同細(xì)胞之間的重要信使，其通過攜帶lncRNA、miRNA、mRNA和其他分子參與多種生物過程，并在包括AF 在內(nèi)的許多疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15-16］。然而，外泌體和外泌體miRNA 在AF 發(fā)展中的作用仍未完全闡明。本研究證明了miR-130 在AngⅡ-Exo 中表達(dá)增加。AngⅡ-Exo 可以通過轉(zhuǎn)移miR-130 促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 極化并抑制M2 極化。巨噬細(xì)胞是AF 發(fā)展中的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞。研究表明M1 巨噬細(xì)胞比例的上調(diào)和M2 巨噬細(xì)胞的下調(diào)均可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的惡化，并促進(jìn)心房纖維化和AF 發(fā)展。例如，ZAMAN 等發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞有助于抵抗遠(yuǎn)端心肌的重塑［17-18］，心臟巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加與小鼠的年齡呈正相關(guān)。本研究進(jìn)一步表明抑制AngⅡ-Exo中miR-130 的表達(dá)通過抑制M2 巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放?；谶@些發(fā)現(xiàn)，筆者認(rèn)為外泌體miR-130可能是AF的潛在治療靶點。

已顯示miRNA 可調(diào)節(jié)整個基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并在AF 中發(fā)揮重要作用［19-21］。miR-130 是一種腫瘤促進(jìn)因子，研究發(fā)現(xiàn)其參與各種癌癥的進(jìn)程［22-24］。miR-130 可以增加由I/R 損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［25］。此外，miR-130 通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達(dá)和一氧化氮的產(chǎn)生參與AF 的發(fā)病機(jī)制［8］。這些研究表明miR-130 不僅與癌癥有關(guān)，而且與心臟病有關(guān)。更重要的是，miR-130 與膠原蛋白1 和膠原蛋白3 的合成有關(guān)，這促進(jìn)了心臟纖維化的形成［8］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-130 在AngⅡ處理的TAC小鼠和心房肌細(xì)胞衍生的外泌體中表達(dá)上調(diào)，表明miR-130 對心臟纖維化的調(diào)節(jié)作用。此外，miR-130 敲低抑制了心臟纖維化模型中的纖維化，并抑制了心房組織中M1 巨噬細(xì)胞極化。這些結(jié)果證實AngⅡ刺激心房肌細(xì)胞衍生的外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-130 促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而促進(jìn)了心臟炎癥環(huán)境的形成，加速了心臟纖維化。

總之，本研究證明，在AngⅡ處理的心房肌細(xì)胞衍生的外泌體中miR-130 的表達(dá)水平升高，并且外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-130 促進(jìn)了M1 巨噬細(xì)胞極化。該研究表明miR-130 是AF 的潛在治療靶點，應(yīng)進(jìn)一步深入了解miR-130 促進(jìn)心肌纖維化的分子機(jī)制。